病毒病防控岗位

任芳 董雅凤 范旭东 张尊平 胡国君

  葡萄病毒A （ G r a p e v i n ev i r u s A ， G VA ） 为线性病毒科（F l e x i v i r i d a e ） 葡萄病毒属（Vitivirus ）的代表种，是葡萄皱木复合病（Rugose wood complexdisease）的重要病原之一，可引起葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡。GVA在我国和世界各葡萄产区普遍发生。我国农业行业标准《葡萄无病毒母本树和苗木》（NY/T1843-2010）中规定无病毒母本树和苗木不得携带GVA，因此，建立该病毒的快速、准确检测方法十分必要。目前GVA常用快速检测方法为ELISA和RT-PCR，但采用上述2种方法检测带毒植株嫩叶，很难检测到GVA，为此，本实验室研发了更加灵敏、高效的实时荧光定量RTPCR（RT-qPCR）检测方法，并采用此方法对GVA在葡萄植株不同时期和不同组织部位中的相对含量进行测定分析，以明确该病毒在葡萄体内的分布规律和季节动态，为检测样品的采集时间和组织部位选择提供依据，从而提高葡萄病毒A的检测灵敏度和可靠性。

  1　材料与方法

  于2018年6、7、8、9、10月分别采集感染GVA葡萄植株上部嫩叶、嫩叶柄、下部老叶、老叶柄、卷须和枝条6个部位样品，11月份采集休眠枝条样品作为待测样本。采用改良吸附柱法提取总RNA，每个部位取3份样品混合后提取总RNA，采用去除基因组DNA反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser，Takara）进行去DNA处理及反转录：取5×gDNA Eraser buffer 2.0μL，gDNAEraser 1.0μL，总RNA 1.0μL混匀，42.0℃ 2min；加入以下混合液：PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL；37℃15min，85℃ 5s，合成cDNA放置于–20 ℃保存备用。

  以GVA目的基因引物QA2F/2R和葡萄内参基因GAPDH-F/R和EF1α-F/R引物，采用GVA RTqPCR方法对样品进行相对定量分析。反应在实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD CFX ConnectTMReal-Time System）中进行，反应体系25μL，包含：2×SYBRGreenⅠqPCR Mix 12.5μL、1 0 μ m o l • L - 1 正、反向引物各0.5μL、DNase/RNase Free dH2O10.5μL 和cDNA 1μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃ 15s，60℃15s，72℃ 20s，40个循环，在延伸步骤记录荧光信号。熔解曲线分析温度范围从60 ~ 95 ℃，其中每5 s 增加温度0.5 ℃，用于鉴别引物二聚体和非特异性扩增。RT-qPCR扩增时每板均添加GAPDH-F/R和EF1α-F/R作内参基因从而对定量分析结果进行校正，以GVA阳性样品cDNA稀释50倍为阳性对照，以健康葡萄植株样品为阴性对照。定量分析时以阳性对照表达量为1，利用Bio-Rad CFX Manager软件进行多板合并分析，确定每个待测样品中GVA相对含量。

  2　结果与分析

  对6 ~ 1 0 月葡萄不同时期上部嫩叶、嫩叶柄、下部老叶、老叶柄、卷须和枝条，以及11月休眠枝条等样品中GVA的相对含量测定结果表明，该病毒在寄主不同组织部位间分布不均匀，在生长季中随着季节变换浓度变化较大。不同组织部位间比较，枝条和老叶柄中病毒浓度最高，其次为老叶。枝条中的葡萄病毒A浓度6月最低，随后开始逐渐升高，8月到达最高，随后浓度略有降低。老叶柄中葡萄病毒A浓度随着时间推移逐渐升高，10月到达最高，高于同时期枝条中的浓度水平。从6月开始老叶中葡萄病毒A浓度随着植株生长逐渐升高，8月到达最高，随后逐渐降低，到10月浓度与6月基本持平，呈正态分布。

  嫩叶柄和卷须中葡萄病毒A浓度在早期（6~8月）很低，到秋季9~10月浓度明显升高至中等水平，嫩叶中葡萄病毒A浓度最低，在整个生长季中均难以达到检测水平（图1）。

  总体来讲，葡萄植株幼嫩组织部位中GVA病毒较低，特别是嫩叶中，几乎难以达到检测水平。成熟组织部位中病毒浓度普遍较高。在生长季早期，植株体内GVA浓度较低，随着季节变化浓度逐渐升高，到秋季后病毒在植株体内各部位间分布更为均衡（图2）。因此，在病毒检测时，尽可能选择夏秋季及以后的成熟组织材料，特别是老叶柄和枝条材料为最佳，其中病毒浓度较高，检测准确度更高；嫩叶中GVA浓度在整个生长季均很低，难以达到检测水平，不适合作为病毒检测材料。