质量安全与营养品质评价岗位
刘真真 齐沛沛 狄珊珊 汪志威 徐浩 赵慧宇 王强 王新全
摘 要：基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法建立葡萄中链霉素残留的定量分析方法。葡萄样品采用磷酸溶液（pH=2）超声提取，经Oasis HLB固相萃取净化后，BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm）分离，以含0.1%甲酸水溶液和甲醇溶液为流动相进行等度洗脱，采用正离子电喷雾离子源（ESI +）多反应监测（MRM）模式下测定，外标法定量。该方法在10~500 μg/kg质量浓度范围内线性关系良好，R2为0.9922；在10、20 和100 μg/kg 三个添加水平下的平均回收率为78.7%~84.2%，相对标准偏差为0.92%~2.0%；定量限为10 μg/kg。该方法快速、准确、灵敏度高，适用于葡萄中链霉素残留量的检测分析。
关键词：链霉素；固相萃取；液相色谱-串联质谱法；葡萄
链霉素(Streptomycin)是一种广谱氨基糖苷类抗生素，常作为饲料添加剂和治疗动物疾病的抗生素在畜牧业上广泛应用。然而，自1985年日本学者小笠原发现链霉素可以诱导葡萄无核结实的现象以来，链霉素在葡萄生产中得以广泛使用。链霉素容易损害听觉神经，严重时会导致耳聋，对肾脏也有毒性；其通过食物链进入人体，危害人类健康。因此，为了保证葡萄质量安全，建立高灵敏，高准确度的链霉素残留检测技术必不可少。目前，已有报道主要针对牛奶，蜂产品，番茄酱等样品中链霉素展开研究，对葡萄中链霉素残留分析的研究较少。链霉素残留分析方法主要有分光光度法，液相色谱法，液相色谱-串联质谱法( LC-MS /MS)等。其中，液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）具有高灵敏度、高选择性和高通量分析的优势。因此，本研究选取夏黑葡萄为代表，基于液相色谱-串联质谱法建立快速简便、灵敏度高的链霉素分析方法，为葡萄中链霉素的残留监控提供有力的技术支持。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Nexera X2 LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司）和液相色谱-串联质谱法分析葡萄中链霉素残留量研究Shimadzu 8050三重四极杆串联质谱仪（日本岛津公司）；Labsolution软件（日本岛津公司），用于仪器控制、数据采集和结果分析；色谱柱为Waters BEH C18 (100 mm×2.1mm, 1.7 μm, 美国Waters 公司)；Filter Unit 滤膜（0. 22 μｍ，天津Agela Technologies公司）；高速离心机（Thermo 公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
链霉素分析标准品（德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；商品化OasisHLB固相萃取柱（500mg/ 6mL, 美国Waters 公司）；甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；磷酸（色谱纯，美国Tedia公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia公司）；实验用水为超纯水（Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司）；1-己烷磺酸钠（分析纯，Macklin公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理过程
称取葡萄样品5.00 g（ 0.05 g）于50 mL离心管中，准确加入10 mL磷酸溶液（pH=2），超声萃取15min，涡旋1 min，在7000 r/min条件下离心3min，取上清液。随后向上清液中加入2 mL的1-己烷磺酸钠（0.5 mol/L），混匀，静置10min。然后上清液倒入经 5 mL甲醇活化、5 mL 水平衡的Oasis HLB小柱内，待样液全部流尽后用5 mL磷酸溶液（pH=2），10 mL 水淋洗，负压抽干后，5 mL甲醇洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，氮吹至1 mL，涡旋混匀后过0. 22 μm 滤膜，供LC-MS /MS 分析。
1.2.2 LC-MS/MS分析方法
采用Shimadzu 8050液相色谱-串联质谱仪进行葡萄中链霉素残留的分析测定。色谱柱为Waters BEHC18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流动相为水和甲醇( 1:1, v/v)，其中水相中加入0.1%甲酸，流速为0.3mL/min，柱温35℃，进样量2μL。质谱条件：采用电喷雾离子源，多反应监测模式(MRM)，加热温度400 ℃，喷雾电压：正源3500V。链霉素化合物由两对母离子-子离子对共同确定，链霉素MRM前体离子、产物离子及相应的碰撞能和偏差经方法优化后条件见表1，表中标注*子离子为定量离子。
2 方法验证
2.1.1 线性关系和灵敏度
配制链霉素的基质标准溶液，其质量浓度梯度为 0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.4、0.5 mg/L。经LC-MS/MS分析后，以色谱峰面积（y）对分析物质量浓度（x, mg/L）进行线性拟合，得出回归方程及相关系数。结果显示，链霉素在0.01～0.5 mg/L范围内具有良好的线性关系，线性方程为y＝430077x-5128.2，线性相关系数（R2）为0.9922。检出限（LOD）为3倍信噪比所对应的化合物质量浓度，本方法中链霉素LOD值为2.0 μg/L。欧盟文件SANTE/11945/2015规定定量限（LOQ）为实验中最低添加浓度水平，且回收率必须满足实验工作需求。本试验的最低添加水平为10μg/kg，链霉素的回收率为78.7％（见表2），故本方法中链霉素的LOQ为10 μg/kg。
2.1.2 回收率及精密度
使用空白葡萄基质进行添加回收率试验， 添加水平分别为10、20 和100μg/kg（每个添加水平平行测定3次），按照本方法进行试验，结果见表2（其中添加水平为100μg/kg的样品经洗脱后直接进样，未浓缩）。 链霉素在不同添加水平下平均回收率为78.7％～84.2％，RSDs为0.92％～2.0％。方法的准确度和精密度均符合分析要求。
3 结论
本研究采用磷酸溶液（pH=2）超声提取，Oasis HLB固相萃取净化，0.1%甲酸水-甲醇（1:1，V/V）为流动相等度洗脱，并结合LC-MS/MS定量分析的优势，建立了葡萄中链霉素的快速分析方法。整个操作过程简单、仪器分析时间短、准确度高，适于链霉素含量的定量分析，为葡萄中链霉素的快速准确测定提供新的方法依据。