制干鲜食兼用品种改良岗位
王勇 李玉玲 孙锋 伍国红 骆强伟
试验利用SSR标记技术对本岗位选育的19个葡萄品种（系）进行基因多态性和特异性测定与分析，并构建种质指纹图谱，为自育葡萄品种鉴定、种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
试验于2019年1月至2019年11月在新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所完成。
1.2 试验植物材料
新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所育种材料资源圃多年生的新郁、新葡1号、紫霞、新雅、火州紫玉、火州红玉、火州黑玉、戈壁新秀、SP522、SP122、SP137、SP8028、SP10140、SP6164、
SP4614、SP891、SP275、SP115、SP4287等19个自育葡萄品种（系）植株，及红地球、巨峰、无核白、里扎马特、无核白鸡心等5份品种资源，具体见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 引物序列
通过查阅文献，获得多态性信息量较高（PIC）SSR引物序列16对，并委托擎科生物技术公司进行了序列合成，如表2：
1.3.2 样品基因组DNA的提取
采用改良的CTAB法提取葡萄叶片的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，检测提取的基因组DNA的片段长度、浓度和纯度；通过分光光度计测定并计算DNA溶液的OD260/OD280、OD260/OD230值，若前者值在1.60-1.90之间，后者值>2.0可用于PCR扩增。
1.3.3 PCR反应体系及反应程序
使用PCR反应体系为：PCRMiX混合液（ ng•μL-1）10μL，SSR双引物混合液（ ng•μL-1）0 . 8 μ L ， 模板（ 2 0 n g •μ L - 1）2.0μL，dd H2O 7.2μL，总反应体系为20μL，PTC-100型PCR仪上进行反应。
扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性40s，45-65℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后一个循环72℃延伸10min；停止于4℃。在操作中根据各引物差异进行体系优化。
1.3.4 PCR产物的电泳分离及分析
利用2%的琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行水平电泳检测，若有扩增结果不理想的，需要进行补充，然后将产物进行低温包装，邮寄给擎科生物技术公司进行毛细管电泳检测产物片段种类和大小。
1.3.5 数据分析
利用PowerMarker v3.25 软件计算引物位点在所有供试材料的等位基因个数、 基因型个数、 等位基因频率，依据所得的等位基因频率，计算各标记位点的多态性信息含量（PIC），公式：
Pij 是第 i 个标记位点的第 j 个等位基因的频率。
数据标准化处理方法参考陈昌文等的方法。根据每对引物对不同种质扩增片段对应的分子量大小，按从小到大依次编码为 1-8。同时参考桃分子身份证的构建方法，当引物扩增的某一品种等位基因有 2个时，按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值。
2 试验结果与分析
2.1 葡萄基因组DNA 提取质量检测
从图1可以看出，基因组 DNA片段完整，浓度很高，可以用做模版，进行PCR扩增。
2.2 PCR产物的检测
从图2 可以看出， 引物VVMD6、Vchr15a的PCR产物条带清楚、完整，可以用来进行毛细管电泳检测。
2.3 16对SSR标记引物对19个品种（系）的扩增结果
由表 3 可以看出，利用 16 对SSR 引物对24份葡萄种质资源进行扩增，共有79个等位位点，扩增出128个等位基因，平均每个SSR引物有8对等位基因，平均每个 SSR 位点有 4.94 个。扩增产物片段大小的变幅为109-252bp，每个位点的基因型个数变幅为4（VrZAG29）-16（VrZAG67）。16 对引物中扩增出等位位点数最多的是VVMD7和VrZAG67，最少的是VrZAG29、SCU15vv和VVMD6；多态性信息指数（PIC）变化范围为 0.36-0 .92， 平均为 0 . 7 5 ； 其中引物VrZAG67的 PIC 值最高为 0.92，引物 VrZAG29 的 PIC 值最低为0.36，可见，等位位点的多少与多态性信息含量的高低不存在比例关系。多态性信息指数（PIC）是用来衡量 SSR 引物多态性高低的一个重要指标。按照Botstein 等提出的衡量基因变异程度高低的多态性信息量指标，指出当 PIC>0.5 时，该引物为高度多态性信息引物，当0.25<PIC<0.5 时，该引物为中度多态性信息引物，当 PIC<0.25 时，该引物为低度多态性信息引物。本试验筛选出的 16 对 SSR 引物，除VrZAG29外，均为高度多态性引物。这表明15 对SSR引物能以较高的信息量反映出葡萄品种的基因型多样性水平，能够用于分析葡萄种质资源的遗传多样性水平。
2.4 构建1 9 个自育葡萄品种（系）指纹图谱
根据电泳结果，选择多态性信息较高的引物7对，构建指纹图谱。对 7 对引物在供试种质扩增的等位基因谱带大小分布范围进行赋值。本研究中引物扩增最多的等位基因数为8，故赋值范围为 1-8（表4）。为了保证分子身份证字符串的每位上只有 1 个字符，对同一引物下的扩增条带只选择位点较小的进行分子编码。根据表 4 中等位基因的赋值标准和各引物对品种的扩增结果，对 19 份供试葡萄品种进行分子编码，结果（表 5）显示，用选取的 7对引物可以将 19个品种（系）进行有效区分。SP4614具有3个特异等位基因（VVS2-143、SCU06-177、VVMD7-250），
SP6164、SP8028、SP10140各具有一个特异等位基因（ 分别为VVMD7-242、VrZAG79-182、VrZAG62-191）。
如表6 所示， 试验按照引物多态性信息量（ P I C ） 的高低顺序对品种进行区分， 引物VrZAG67（PIC为0.92）能够区分SP137、SP10140两个品系，VrZAG67+VVS2可以区分9个品种(系)，VrZAG67+VVS2+SCU06仍是区分9 个品种( 系) ，VrZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7可以分区1 3 个品种( 系) ，VrZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+ V c h r 4 a 可以分区1 7 个品种（系），最后在增加引物VVMD5才能将紫霞和新雅区别开来，这说明紫霞与新雅的亲缘关系很近。按照分析结果对19个品种（系）进行7位数字编码赋值（见表5）
3 结论
本研究利用16对SSR标记引物对19个自育葡萄品种（系）开展了基因型和遗传多样性的测定，从中选择了7对多态性信息量相对较高的SSR标记，完成了品种（系）的指纹图谱构建，并对其进行了赋值编码，形成了身份识别码。但由于葡萄种质共有上千余份，而分子身份证的最终目的是对所有种质均赋予可辨的分子身份证，在本试验中初步构建的种质分子身份证已经有7位，如果继续对更多的品种构建分子身份证，需要增加 SSR 引物数量，进而增加分子身份证的位数。