石家庄综合试验站

  ‘巨峰’，四倍体品种，属欧美杂种，为日本育成，1959年引入中国试种。而后因其适应性强、抗病、抗寒、果粒大、色泽好、风味佳而深受果农和消费者欢迎，逐渐在全国各地大面积推广。目前，巨峰葡萄已成为广大地区主要的葡萄品种之一。

  葡萄果皮颜色是果实外观品质的重要指标之一，花色苷在果皮中积累的数量和其构造的差异决定了果皮的颜色,大致可以分为黑、红、白色。花色苷是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，具有极强的抗氧化能力和清除自由基的作用，并能预防心血管疾病，因此，花色苷目前被广泛用于食品、医药、化妆品等各个行业。葡萄浆果中花色苷的组成比例及含量不仅决定着葡萄果实的颜色，同时对葡萄酒的质量也有非常重要的影响。

  当前，随着花色苷代谢途径研究的逐渐深入，生物合成途径已有明晰的轮廓。在对葡萄浆果发育过程中与花色苷合成相关的基因进行表达分析后，发现只有尿苷二磷酸葡萄糖-类黄酮葡萄糖基转移酶（UDP-glucose 3-O-flflavonoidglucosyltransferase，UFGT）基因在葡萄浆果转色后表达，而且在白葡萄中表达水平比在有色葡萄中低很多，由此确定了UFGT是决定葡萄浆果颜色的关键基因。随着研究的深入，越来越多的参与花色苷生物合成的基因被鉴定，人们发现花色苷的生物合成需要两类基因的参与，一类是结构基因，编码直接参与花色苷合成与积累的酶；另一类是调节基因，调控结构基因的时空表达。Kobayashi等利用Northern blotting技术对葡萄UFGT基因的转录调控做了一系列深入研究，克隆出了8个MYB（v-mybavian myeloblastosis viral oncogenehomolog）相关基因，并证实其中MYBA基因与UFGT的表达密切相关；后续研究表明，在很多欧亚种（Vitis vinifera L.）葡萄中都发现了能够调节UFGT的表达从而参与欧亚种葡萄花色苷生物合成的VvmybA1基因，而且VvmybA1在白色欧亚种葡萄品种的果皮中不表达，在所有有色葡萄品种的果皮中表达。

  鉴于巨峰葡萄的遗传背景复杂，揭示其花色苷代谢与调控规律更困难。本园区巨峰自交后果皮颜色出现了典型的性状分离，出现了众多的中间表型。现以巨峰葡萄与其自交后代为试材，对其果皮色素遗传进行进一步研究, 旨在为揭示巨峰葡萄果实色泽遗传提供理论基础。

  1　材料和方法

  1.1　材料

  2010年5月以‘巨峰’（ V.vinifera ×V. labrusca ）自交，秋季采收种子，10月份至2011年2月进行层积处理，3月份对自交种子催芽以及播种，6月份进行移栽和定植，现所有实验材料均栽植于石家庄果树研究所葡萄试验园，均长势良好，挂果成熟稳定。其中，自交后代出现果皮颜色的性状分离，出现了不同的色泽。本试验选取‘巨峰’（kyoho）、黄色（white）、粉色（pink）、黑色（black）后代为试材，分析颜色变异的遗传机理。在进入果实成熟期开始，对样本植株的果实成熟度进行跟踪观察，发现果实成熟后随即进行取样。取样方式为每个植株采集3穗果实，均匀从每穗的上中下剪取果粒，收集一部分样品用于单果质量、可溶性固形物以及糖酸含量测定，另一部分存放于自封袋内，做好标记，液氮速冻，-80℃保存备用。

  1.2　方法

  1.2.1　果实单果重、糖、酸的测定

  随机选取20粒果实，利用电子天平称重并求得单果重量。随机选取10粒果实，利用粉碎机打成匀浆，并用纱布过滤，用手持糖度计测定滤液的可溶性糖（TSS）。可滴定酸的测定参照GBT15038-2006的办法。

  1.2.2　果皮花色苷的测定

  花色苷的测定参考杨夫臣等的方法，并略有改动：准确称取液氮研磨的果皮粉末1g，以预冷的1%盐酸-无水甲醇溶液（pH=2）作为浸提液，4℃遮光浸提1h，4800rpm离心10min，吸取上清液，冲洗沉淀2次，定容到50ml待测。以1%盐酸-无水甲醇溶液作空白参比调零，选取巨峰定容后的溶液，测定450～600nm的吸收光谱，确定巨峰葡萄色素的最大吸收峰，并测定各溶液的吸光度值，重复3次。葡萄果皮中花色素含量的计算参照张昭其等的方法：花色素含量 (mg/g)=A×V×1000×455.2/ 29600×d×m。式中：A：最大吸收波长处吸光度值；V：定容体积(L)；1000：g换算成mg扩大的倍数；455.2：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子质量(g/mol)；29600：矢车菊素-3-葡萄糖苷的浓度比吸收系数(L/mol•cm)；d：比色杯光径(cm);m:鲜质量(g)。

  1.2.3　果皮总RNA的提取与cDNA合成

  使用植物总RNA提取纯化试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取葡萄果皮的总RNA。用1.0%凝胶电泳检测RNA质量。使用Revert Aid First Strand cDNASynthes is Kit试剂盒（Thermoscientific公司）将提取的RNA反转录成cDNA。

  1.2.4　花色苷合成相关基因荧光定量表达分析

  根据本课题组转录组测序得到的转录组数据，参考NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）基因序列，采用在线设计工具Primer-BLAST设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表）。以‘巨峰’及其3个不同颜色的的后代果皮cDNA为模板，使用SYBR PremixEx Taq Ⅱ试剂（TaKaRa公司）进行PCR扩增。qPCR 体系为：cDNA模板3.5μL，上下游引物各0.4μL，Mix10μL，ddH2O 5.7μL。qPCR程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃延伸1min，共循环40次，在65℃-95℃进行溶解曲线分析。以actin 的表达水平为内参，基因的相对表达量按BIO-RAD CFX荧光定量仪使用说明进行分析。以‘巨峰’白色后代（White）作为对照，即表达量为1，数据使用Origin 9.0软件进行处理。

  2　结果与分析

  2.1　果实的理化性质与花色苷的测定

  由图2可知，成熟期各试材单果重除白果最小外，其余果重差异不大。然而，可溶性固形物差异明显，白果最大（21.87%），粉果最小（18.5%），亲本巨峰居中分布。可滴定酸含量差异不大，变化范围为4.21-4.76mg/g，白果最高，粉果最低，亲本巨峰居中分布。综上所述，各试材均处于成熟期，其中白果的糖酸特点属于高糖高酸型，而粉果为低糖低酸型。本研究中巨峰自交组合后代出现较大的性状分离，分别出现了白、粉红、紫、黑等多个果皮色泽表型。选取了具有代表性的白、粉红、黑三个后代进行花色苷测定。由图2可知，亲本巨峰的总花色苷含量为1.59mg/g，浸提液呈浓紫色；白果的花色苷最小，仅为0.097mg/g，浸提液呈淡黄绿色；黑果的花色苷最大，为4.25mg/g，浸提液为黑紫色；粉果花色苷含量居中分布。

  综上所述，巨峰自交组合在糖、酸、花色苷性状遗传上存在较大的性状分离，同时存在超亲现象。

  2.2　花色苷相关基因的表达分析

  如图3所示，白果色素相关基因的表达量均低于各有色果实，其中UFGT、F3’5’H、FAMOT基因的表达极低。由此可见，巨峰后代果实出现白果可能是UFGT功能缺失，以致后期FAMOT也不表达，导致色素合成中断，阻碍色素积累。

  粉色果中PAL、MYB90、DFR、F3’5’H、MYBA1基因的表达量低于亲本巨峰、黑果，但CHS1、4CL、F3’H的表达量最高。黑果中多数基因的表达量并不高于巨峰，只有4CL、CHS1、F3’5’H高于巨峰，其中F3’5’H的表达量约为巨峰的4倍，粉果的8.7倍。由此可推测，巨峰有色后代中色泽差异主要是F3’H/F3’5’H基因表达比例不同导致的，比例越低，着色越黑，其中F3’5’H基因为颜色差异的主导。

  3　讨 论

  花色苷生物合成相关的基因分为结构基因和调节基因两类。其中，结构基因直接编码花青素/苷生物合成过程中生物合成酶类（如CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、ANR、UFGT 等）；调节基因则通过调控花青素/苷生物合成结构基因的表达强度和模式，调控花青素/苷的时空积累（如MYB、MYC、WKRY、WD40 等）。有色果实在果皮内积累花色苷，而白色果皮的葡萄品种不能在果皮内合成花色苷，其实质是由于有关基因发生了突变，导致了合成色素有关基因的丢失。本研究中，白果的UFGT、FAMOT的表达量极低，推测是UFGT的基因功能缺失导致花色苷合成受阻。但有研究显示，某些白色葡萄和有色葡萄中的UFGT基因序列分析后却没有发现明显的区别，因此本研究推测还需要后期验证。

  由于VvmybA1的DNA序列中插入了一个逆转座子Gret1导致了VvmybA1的失活，使白色欧亚种葡萄品种的花色苷生物合成基因UFGT的转录受到抑制，无法合成花色苷，从而呈现白色。本研究中，白果与有色果实的mybA1的表达量差异并不是很显著。这可能与巨峰遗传背景的复杂性，MYBA1适用种群的局限性等有关。

  Azuma等研究显示，F3’H和F3’5’H的表达水平决定花青素/花翠素和花色苷的比率，从而影响了葡萄果皮的颜色，而UFGT、OMT、GST基因的表达量也对花色苷的含量具有明显的促进作用。

本研究中，巨峰后代中色泽差异主要是F3’H/F3’5’H基因表达比例不同导致的，比例越低，着色越黑，其中F3’5’H基因为颜色差异的主导，这与前人的研究相一致。