哈尔滨综合试验站

朱磊 覃杨 鲁会玲 肖丽珍

  酚类化合物的含量和组成对葡萄果实的感官和品质起着至关重要的作用，而且这些酚类化合物普遍具有抗氧化和抗炎活性，从而可以预防和治疗如癌症、动脉硬化和糖尿病等多种慢性疾病，还具有延缓衰老和美容的作用。

  葡萄中酚类化合物的含量和组成受很多因素影响，如基因型、气候和栽培措施。应用诱导剂和植物激素也可以有效的促进酚类化合物的合成和积累。脱落酸（ABA）是一种植物内源激素，现已证实葡萄中的内源ABA是调控果实成熟的重要植物激素，内源ABA同时也是葡萄抵御逆境如干旱、寒冷和微生物胁迫等的信号物质。近年来，研究人员又重新考虑其在葡萄栽培中的潜在应用价值，研究表明，在葡萄始熟期应用外源ABA可以促进果实着色和花色苷的积累。

  本研究在始熟期的不同阶段对欧亚种‘美乐’和‘赤霞珠’的果实喷施外源ABA，通过系统分析外源ABA对果实的酚类含量、组成和抗氧化活性的影响，确定欧亚种酿酒葡萄最佳的外源ABA处理时间。

  1　材料与方法

  1.1　材料

  欧亚种 “ 美乐” 和“ 赤霞珠” 的葡萄果实采自天津蓟县（117º39E，24º3N），葡萄园的株行距分别为1m和2.5m，葡萄园采取一致的栽培管理措施，“美乐”树龄8年，“赤霞珠”树龄10年，二者皆为自根苗。

  外源ABA的处理时间为3个：始熟期初期（果穗中有0～5%的果粒着色）、始熟期中期（果穗中有30～50%的果粒着色）和始熟期末期（果穗中有95～100%的果粒着色）。每个品种分为3个处理组和1个对照组，3个处理组分别在不同处理时间向果穗喷施200mg/L的ABA，对照组不喷施ABA，每个实验组为10株葡萄的所有果穗。利用手持式喷雾器直接对果穗喷施ABA溶液，直到果穗有液体流下再停止喷施该果穗。为了防止ABA的光分解，所有处理均在黄昏时进行。实验组的所有果实在达到技术成熟时采摘，在2个植株的上、中、下部位采摘6穗葡萄作为1个平行样，每个实验组有3个平行样，将收集的果实样品置于冰盒中带回实验室立即进行预处理。

  1.2　试验方法

  （1）基本果实品质的测定方法：电子天平称量果实的果粒重，分别利用手持式折光仪和pH计测定果汁的可溶性固形物和pH值，利用滴定法测定可滴定酸含量。

  （2） 酚类化合物的提取方法： 葡萄皮和葡萄籽酚类化合物的提取剂分别为甲醇/ 水/HCI（70:29:1，v/v/v）和0.1%的甲醇溶液，以1:40的料液比在水浴振荡器中室温避光提取2h，离心分离上清液，残渣重复上述提取过程2次，合并3次提取的上清液。

  （3）酚类化合物的总含量测定方法：直接测定提取液的酚类含量，采用福林酚法测定总酚含量，采用NaNO2-AlCl3法测定类黄酮含量，采用香草醛法测定黄烷-3-醇含量。

  （4）抗氧化活性测定方法：采用分光光度法直接测定提取液的DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力（FRAP）。

  （5） 花色苷化合物分析方法：将提取液旋蒸至干，再用储备液定容至5mL。参考Jin等的方法，采用Agilent 1100系列液质联用仪，Kromasil-C18（250 × 4.6 mm,5 μm）色谱柱，质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，进行花色苷化合物定性定量分析。

  1.3　数据分析

  样品的各项指标均含有多个平行样，所有数据都表示为平均值±标准偏差（S.D.），采用SPSS. v19.0在≥95%的置信区间进行方差分析（ANOVA）。

  2　结果与分析

  2.1　外源ABA处理时间对葡萄果实基本品质的影响

  如表1所示为不同时间的ABA处理后成熟葡萄果实的果重、可溶性固形物、可滴定酸和pH值，对于同一品种，不同时间组的各项品质指标与对照组相比均无显著差异（p>0.05），说明在始熟期各阶段对葡萄果实进行外源ABA处理不会影响果实的基本品质。

  2.2　外源ABA处理时间对葡萄果实酚类总含量和抗氧化活性的影响

  不同的ABA处理时间对“美乐”和“赤霞珠”果实的酚类总含量和抗氧化活性如表2所示。

  外源ABA处理不同程度的提高了2个品种葡萄皮的总酚、类黄酮和黄烷-3-醇的含量，“美乐”分别提高了14%～22%、37%～39%和7%～22%，“赤霞珠”分别提高了48%～79%、39%～170%和7%～172%。不同的处理时间对葡萄皮酚类含量的影响存在差异，两个品种始熟期初始组和中期组葡萄皮的总酚、类黄酮和黄烷-3-醇含量显著高于对照组（p<0.05），始熟期末期组的酚类含量，只有“美乐”的总酚和类黄酮显著高于对照组（p<0.05），其他与对照组无明显差异（p>0.05）。对于葡萄皮酚类化合物的抗氧化活性，在始熟期的3个时间点利用ABA处理葡萄果实均能显著提高“美乐”葡萄皮酚类提取物的抗氧化活性（p<0.05），DPPH值和FRAP值分别比对照组增加了126%～178%和98%～139%，而3个“美乐”ABA处理组间的抗氧化活性无显著差异（p>0.05）。“赤霞珠”始熟期初始组和中期组的葡萄皮提取物抗氧化活性与对照组相比显著提高（p<0.05），而末期组效果不明显（p>0.05），DPPH值和FRAP值分别比对照组提高了38%～121%和30%～97%。

  始熟期利用外源ABA处理果实对葡萄籽酚类的总含量和抗氧化活性没有显著影响（p>0.05），而对于各项指标，不同的ABA处理时间组之间亦不存在明显差异（p>0.05），只有“赤霞珠”’葡萄籽的总酚含量在4个处理组之间存在统计学上的差异（p<0.05）。

  2.3　外源ABA处理时间对葡萄果实花色苷含量和组成的影响

  不同时间采用ABA处理后的成熟葡萄花色苷含量和组成如表3所示， “美乐”和“赤霞珠”果皮花色苷的积累量分别增加了1%～143%和53%～94%。“美乐”只有始熟期中期组葡萄皮花色苷总含量显著高于对照组（p<0.05），而始熟期初期组和末期组虽然数量上比对照组高，但不存在显著差异（p>0.05），“赤霞珠”的3个ABA处理组葡萄皮花色苷的总含量都显著高于对照组（p<0.05）。在4个实验组中，两个品种始熟期中期的葡萄皮花色苷总含量最高，“美乐”为8.32 mgMGE / g DW，“赤霞珠”为8.58mg MGE / g DW。

  欧亚种葡萄皮花色苷主要由5种花色素的单糖苷组成，两个实验品种中，3',4',5'-取代花色苷占总含量的85%～91%，甲基化化花色苷占总含量的91%～95%。始熟期的外源ABA处理对两个品种的这三种花色苷组成没有明显而一致的影响。

  在本研究的两个品种中，检测到的酰基化花色苷包括乙酰化和香豆酰化，“美乐”以香豆酰化为主（18%～24%），“赤霞珠”以乙酰化为主（14%～20%）。外源ABA处理后，两个品种成熟果实中酰基化花色苷表现出不同的变化趋势，与对照组相比，“美乐”的ABA处理组乙酰化花色苷升高，香豆酰化花色苷降低，“赤霞珠”则相反，即ABA处理组乙酰化花色苷略有降低，香豆酰化花色苷略有升高，但是其中只有“美乐”的乙酰化花色苷表现出了统计学的显著差异（p<0.05），所以还不足以说明外源ABA对两个品种酰基化花色苷的组成具有显著影响。

  3　讨论

  从总体上，始熟期应用外源ABA提高了欧亚种“美乐”和“赤霞珠”成熟果实葡萄皮的酚类总含量和抗氧化活性，其中始熟期初期和中期的效果普遍显著。但是，始熟期外源ABA的处理对两个品种成熟果实葡萄籽的酚类总含量和抗氧化活性没有影响。Owen 等对始熟期喷施外源ABA的“美乐”葡萄果实中的ABA及其代谢物进行了检测，结果发现只有很少的外源ABA能进入到果实内部并进行代谢，绝大部分仍留在葡萄皮上，葡萄皮上的外源ABA的半衰期为1周，这使得葡萄皮的ABA代谢物二氢红花菜豆酸含量显著增加。这就可以解释外源ABA处理对葡萄皮酚类含量影响显著却不作用于葡萄籽酚类含量的原因。

  红色葡萄品种的花色苷是由始熟期开始合成和积累的，葡萄果实也由绿色转为红色。始熟期应用外源ABA可以增加葡萄果实的花色苷含量，本研究也得到了相似的结果。主要原因是花色苷合成途径中关键酶基因的表达量上调，而且启动花色苷积累的基因PYL1也可由外源ABA上调。在苯丙烷和类黄酮合成途径中的结构基因和转录因子的表达均可由外源ABA上调，本研究也发现ABA处理组葡萄皮中每一个花色苷化合物的含量基本都比对照组高，这也解释了外源ABA对花色苷组成的影响为什么不如对花色苷总含量的影响那么显著。

  始熟期外源ABA的处理对葡萄果实的果重、可溶性固形物、可滴定酸和pH值等基本品质没有影响，这与其他研究的结果一致。因此，当生产目的只是要增进葡萄果实酚类含量、果实颜色和营养价值时，在始熟期进行外源ABA处理是非常适合的。