种质资源收集与评价岗位
吴艳迪 樊秀彩 张颖 姜建福 刘崇怀
摘 要：本研究以‘美乐’葡萄为试材，利用同源比对的方法，寻找葡萄褪黑素合成路径中色氨酸脱羧酶（TDC）、色胺羟化酶（T5H）、5-羟色胺-N-乙酰转移酶（SNAT）、N-乙酰-5-羟色胺甲氧基转移酶（ASMT）基因，结合果实转色过程中褪黑素含量变化规律，探索上述基因在‘美乐’葡萄中的表达特征。结果表明：（1）通过同源比对，从葡萄基因组中筛选到4个VvTDC，7个VvT5H，3个VvSNAT，5个VvASMT作为候选基因。（2）随着果实转色，褪黑素含量在转色初期呈现峰值，随转色程度加深褪黑素含量有所下降，待果实完全转色后又呈上升趋势。（3）在果实转色前后检测到1个VvTDC、3个VvT5H、3个VvSNAT和3个VvASMT基因的差异表达，其中VvT5H1、VvT5H5、VvT5H7、VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3、VvASMT1、VvASMT2 等8个基因表达量变化趋势相似，与褪黑素含量变化规律呈正相关，其中VvSNAT1 基因表达水平与褪黑素含量正相关性达到了极显著水平，推测其在葡萄果实褪黑素合成路径发挥重要的作用。
葡萄作为一种经济栽培果树，营养价值丰富，目前葡萄中褪黑素合成相关基因尚未被鉴定，开展葡萄内源褪黑素含量变化及其合成基因表达规律研究将有助于解析植株褪黑素含量变化的分子机制。本研究以转色期前后的‘美乐’葡萄果实为研究对象，检测其褪黑素合成相关酶基因表达量，结合褪黑素含量积累动态，从转录水平解析合成基因与褪黑素之间的相关性，进一步明确葡萄褪黑素合成路径中的关键基因及其影响褪黑素含量变化的分子机制。
1 材料与方法
试验于2017年在中国农业科学院郑州果树研究所进行。
1.1 试材及取样
‘美乐’果实采自中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州葡萄资源圃。栽培方式采用1m×2.5m株行距。在果实转色期前后：转色前（7月4日）、转色初期（7月10日）、转色后期（7 月18日）、完全转色期（7 月25日）分别采样。选取光照良好的晴天上午进行采样，采样时间为每天上午8：00-9：00。随机选取3个果穗，作为三个重复，每个果穗随机选取20个果粒。用锡箔纸包裹，经液氮冷冻后研磨成粉存放于-80℃超低温冰箱备用。
1.2 褪黑素及其合成前体物质的提取与检测
称取0.5g上述组织粉末置于15mL干净的玻璃管中，加入3mL水和甲醇混合液（50: 50, v/v），涡旋混匀，使样品与溶液充分接触。然后将样品置于冰上，用超声波细胞破碎仪超声破碎7min，于4℃、8000×g离心10min，过0.22μm滤膜后，滤液在-20℃保存于避光样品瓶内，整个提取操作过程在暗光下进行。
褪黑素标准品购于美国Sigma公司，甲醇和甲酸（色谱纯）购于德国Merck公司。在弱光照条件下，将10mg褪黑素标准品溶于1mL纯甲醇，此溶液作为母液储存在-80℃超低温冰箱以防降解。采用改良的UPLC-MS/MS条件，检测样品中褪黑素的含量。外标法定量分析物。所有检测重复三次。用Excel整理试验数据。利用SPSS软件，单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法，计算均值和标准误差，采用LSD法进行p ≤0.05水平下的显著性检验。实验结果均以平均值±标准误差表示（n=3）。待测分析物均表现出良好的线性关系（表1）。
1.3 qRT-PCR分析
1.3.1 RNA提取和反转录
准确称取200mg上述不同发育阶段的葡萄果实冻干粉，采用改良的CTAB法提取总RNA。参照TaKaRa公司DNaseⅠ操作说明消化 DNA，使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整度，微量高精度紫外分光光度计（NanoDrop2000，美国）检测总RNA浓度及纯度。使用Rever Tra Ace q PCRRT（TOYOBO）反转录试剂盒合成cDNA，具体操作步骤参见说明书。用超纯水稀释10倍，于-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 实时荧光定量PCR分析
本研究参考水稻和拟南芥TDC、T5H、SNAT、ASMT基因，在NCBI网站，选择DELTA-Blast检索葡萄基因组中相应的同源基因作为候选基因，设计引物。引物（表2）由苏州金唯智生物科技有限公司合成，qRT-PCR反应采用Roche公司LightCyder 480 SYBR Green IMaster试剂盒在ViiATM 7 Real-timePCR System（Roche，China）上进行。反应体系20μL，包括：10μL的SYBR Green PCR Master Mix、2μL稀释的cDNA、0.5μL上游引物（10μmoL•L-1）、0.5μL下游引物（10μmoL•L-1），ddH2O补至20μL。每个样品3个重复，反应程序如下：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 15s，45个循环。
1.3.3 统计分析
以葡萄内参基因VvEF1r （表2）的Ct值作对照，采用2–△△Ct法计算各基因的相对表达量。使用Excel2010进行数据统计，制作柱形图和折线图。使用SPSS 22.0软件进行显著性方差分析及相关性分析。利用R3.3.1中的ggplot软件包绘制热图，试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 ‘美乐’葡萄果实中褪黑素含量的变化
在每个时期的葡萄果实样品中均检测到褪黑素，且不同时期含量差异较大（图1）。果实转色期前后，褪黑素含量呈现波动性变化。果实开始转色后褪黑素含量上升，转色初期果实中褪黑素含量最高（1.32 ng/g FW），随果实转色程度提高，褪黑素含量逐渐下降（0.87 ng/g FW），待果实完全转色褪黑素含量又有所回升。
2.2 ‘美乐’葡萄果实褪黑素合成酶基因表达量的变化
2.2.1 美乐’葡萄果实VvTDC表达量的变化
作为褪黑素合成路径的第一个酶，TDC 编码的色氨酸脱羧酶在褪黑素合成过程中具有重要作用。本研究中只检测到VvTDC1 的表达，其表达量在果实转色前最高，随果实转色急剧降低（图2）。果实不同发育阶段VvTDC1 表达量与褪黑素含量的变化趋势不一致。
2.2.2 美乐’葡萄果实VvT5H表达量的变化
在‘美乐’葡萄果实转色前后检测到VvT5H1、VvT5H5、VvT5H7三个同源基因的表达，在不同发育阶段表达量变化趋势基本一致。果实进入转色期基因呈高水平表达，果实转色后期表达量降低，果实完全转色后，其表达量升高（图3）。这三个基因表达量变化趋势与褪黑素含量变化规律基本一致。在果实转色过程中，VvT5Hs 基因表达量升高有助于果实中褪黑素的积累。
2.2.3 美乐’葡萄果实VvSNAT表达量的变化
在‘美乐’葡萄果实中检测到VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3 表达，它们与拟南芥AtSNAT 氨基酸序列相似性分别是74.3%、74.1%和45.1%，不同发育阶段基因表达量变化趋势相似。果实进入转色期褪黑素含量迅速增加，VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3 表达量也升高（图4）。这三个基因在果实转色过程中的表达量与褪黑素含量变化趋势基本一致，其中VvSNAT1 表达量在各个时期均高于其他两个基因。
2.2.4 美乐’葡萄果实VvASMT 表达量的变化
从筛选到的5个VvASMT 基因中，只检测到VvASMT1、VvASMT2和VvASMT5 的表达。VvASMT1 和VvASMT2 表达量变化趋势相似，在果实转色期前后呈现升高-降低-升高的趋势。不同发育时期VvASMT5与其他两个基因表达量变化趋势存在明显差异，其表达量在转色之前最高，之后持续降低，果实完全转色后，VvASMT5 表达量变得很低（图5）。
2.3 褪黑素含量与其合成基因表达量的相关性分析
用双变量Pearson法分析‘美乐’葡萄果实转色过程中褪黑素含量与合成基因表达量的相关性。除VvTDC1 表达量与褪黑素含量相关性呈负相关（r=–0.004）外，其他基因表达量与褪黑素含量呈现不同程度正相关。其中VvSNAT1 表达量与褪黑素含量呈极显著正相关（r=0.964），VvT5H1、VvT5H5、VvSNAT3、VvASMT2 表达量与褪黑素含量呈显著正相关(r=0.940、0.908、0.887、0.937) ， VvTDC1、VvT5H7、VvSNAT2、VvASMT1、VvASMT5 表达量与褪黑素含量的相关性未达到显著水平（表3）。表明VvSNAT1基因可能是葡萄果实褪黑素的重要合成基因。
3 讨论
本研究从葡萄基因组中筛选到4个VvTDC 基因、7个 VvT5H 基因、3个VvSNAT基因、5个VvASMT基因。在‘美乐’葡萄果实中只检测到1个VvTDC 、3个VvT5H 、3个VvSNAT 、3个VvASMT 基因的表达，这些基因表达量因果实发育阶段表现出差异。VvT5H1、VvT5H5、VvT5H7、VvSNAT1、VvSNAT2、VvSANT3、VvASMT1、VvASMT2等8个基因在时间顺序上的表达模式相似，果实转色过程中先上调表达后下降之后又上升，随着果实转色呈波动性表达。Lei Qiong等（2013）证明，在‘红富士’苹果不同发育期果实中褪黑素含量与褪黑素合成基因（MdTDCs、MdSNATs、MdASMTs ）表达量呈正相关。本研究也发现在葡萄果实转色期前后，褪黑素含量变化与其合成酶基因表达量呈正相关，表明葡萄褪黑素的合成可能与这些基因的差异表达有关。
在水稻中过表达OsSNAT 可以提高植株褪黑素含量，延缓叶片衰老，提高植株对钙盐胁迫的抗性。敲除AtSNAT基因的转基因拟南芥植株褪黑素含量大大降低，抗病性也受到抑制。这些结果表明SNAT对植物褪黑素合成具有重要作用。本研究中，在‘美乐’葡萄果实转色期前后VvSNAT1 与褪黑素含量呈极显著正相关，表明VvSNAT1 在葡萄褪黑素生物合成过程中可能具有重要的作用。
TDC 基因编码的色氨酸脱羧酶催化褪黑素合成的第一步反应，在调控植物体中褪黑素含量中发挥决定性作用。樱桃、山羊草、芍药等植物中TDC 基因表达量与褪黑素含量变化呈正相关，TDC 基因表达量升高可促进褪黑素合成。本研究中VvTDC1 表达量与褪黑素含量变化相关性不强，VvTDC1 下调表达的具体原因还不得知，可能因为葡萄中存在多条TDC 同源基因，而本研究筛选的VvTDC1 基因不参与‘美乐’葡萄果实转色期前后褪黑素的合成。也可能是因为植物中褪黑素合成基因是多拷贝，果实不同发育期由不同褪黑素合成酶基因负责合成。但对于造成VvTDC1 表达量持续降低的原因有待进一步研究。