贺兰山东麓综合试验站

宋双 姜彩鸽 王国珍 樊仲庆 张怡

 

  摘　要：为了解决葡萄霜霉病菌的活体保存问题，本文开展了多种保存方法的研究。研究5%二甲基亚砜低温冷冻保存、单斑病叶液氮冷冻保存和单斑叶片琼脂粉包裹冷冻保存等三种保存方式在不同低温条件下和不同保存时间对孢子囊致病性的影响。结果表明：葡萄霜霉病菌单斑病叶用不同保护剂处理后保存于-80℃中30d，5%二甲基亚砜处理的孢子囊经回接后发病面积百分率为69.32%，其致病性明显高于液氮冷冻处理和琼脂粉包裹处理；两种低温保存，在-80℃中保存的孢子囊回接后致病性明显高于-20℃的处理；三种保存方式均随着保存时间的延长，致病性逐渐降低。

  关键词：葡萄霜霉病菌；保存剂；保存温度；保存时间

  葡萄霜霉病菌（Pl a smopa r aviticola )属卵菌门单轴霉属，是一种专性寄生菌。无性阶段产生孢囊梗，顶生孢子囊，内生游动孢子。病菌的有性生殖产生卵孢子，于秋末在病部细胞间隙处产生。

  由于葡萄霜霉病菌是一种专性寄生真菌，一旦离开宿主生物就不能继续生存，到目前为止在合成培养基上无法进行培养和保存，这给在非发病时间下研究该病菌造成很大困扰。因此，有必要寻找到有效的保存菌源的方法。目前国内外有关专性寄生真菌体外保存的报道很多。如Gill和Davidson报道，蚕豆霜霉病菌的分生孢子用保护剂进行处理后在－80℃中可保存一年，回接感病品种的叶片后，发病面积比例超过50%；Gulya等报道，经过快速冷冻干燥后向日葵霜霉病菌的游动孢子囊可以在液氮中储存4年，这种冷冻干燥技术在瓜类霜霉病的致病菌孢子囊的保存中也获得成功，但对于玉米霜霉病菌的保存不可行；Bromfield 和 Schmitt的研究表明，使用DMSO作为烟草霜霉病菌的冷冻保护剂，分生孢子在-180℃液氮中储存25个月后仍保留其活性和感染性；郝永娟研究发现，通常黄瓜霜霉病菌的孢子囊在－30℃条件下保存40d以内感染成功，并在50d后丧失其侵染力；张艳菊认为，黄瓜霜霉病菌的适宜储存条件为10%二甲基亚砜加5%脱脂奶在－20℃预处理24h，以这种方式储存的孢子囊再在－70℃条件下保存，即使在12个月后仍然表现出较高的致病性；杜兴兰等报道，使用5%二甲基亚砜作为保护剂保存葡萄霜霉菌的孢子囊，在－76℃条件下储存240d后，与对照相比没有显著差异。

  真菌活体保存的目的是提高菌株的生存力和稳定性，但难以保存不能在合成培养基上生长的专性寄生菌。因此，通过研究不同保护剂和保存条件，探索了葡萄霜霉病菌的较长期的保存方法，解决了葡萄霜霉菌不可能长时间保存并且致病性降低的问题，为研究该病原菌的生物学特性、病因和预防措施奠定了良好的基础。

  1　材料与方法

  1.1　材料

  1.1.1　供试菌株

  在金山试验区葡萄种植基地赤霞珠品种上，于病害发生期采集葡萄霜霉病菌样品，样品均为生长良好的单斑病叶，每片叶用报纸分隔开，装入放有冰袋的泡沫箱中，带回实验室。将采回的新鲜葡萄霜霉病单斑病叶先在流水下冲洗至病叶表面干净（每片病叶分开冲洗，不能混一起），再用装有蒸馏水的小喷壶喷洗病叶表面，喷洗掉叶片表面残留的霜霉病菌霉层，之后将其置于铺有4层湿润纱布的瓷盘内，叶片背面朝上，用浸湿的棉花包裹叶柄，用吸水纸吸干叶表面残留的水珠，用保鲜膜包裹封口，蒙上黑布置于室温条件（20℃±2℃）下保湿培养24h～36h，等到病叶上产生新的白色霜霉层后，供保存试验使用。

  1.1.2　供试葡萄品种

  金沙林场种植的高感霜霉病的品种红地球，采摘植株新生枝条的第3～5节健康叶片，用于不同的保护剂、保存温度和保存时间的葡萄霜霉病菌孢子囊接种用。

  1.1.3　主要试剂和仪器

  试验所用保护剂为二甲基亚砜（DMSO）、液氮和琼脂粉，二甲基亚砜按照5%的浓度配好后要先经过灭菌再使用；所用植物培养箱的型号：MLR-352H-PC（日本制造）、-20℃冰箱的型号：BCD-215TD GA（中国制造）、-80℃超低温保存箱的型号：DW-86L578J（中国制造）。

  1.2　方法

  1.2.1　不同保护剂对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  在经过保湿培养后长出新霉层的病叶中，挑选具有相似的形状和霉层厚度的病斑，用消过毒的剪刀将病斑剪成三等份，并用三种保护剂分别保存。第一种方法是将葡萄霜霉病菌单斑放入1.5ml的塑料离心管中，再倒入液氮将其完全浸没；第二种方法是将葡萄霜霉病菌单斑放入1.5ml的塑料离心管中，再加入琼脂粉将其埋没；第三种方法是将葡萄霜霉病菌单斑放入1.5ml的塑料离心管中，再用5%二甲基亚砜将其浸没。

  1.2.2　不同保存温度对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  将三种保护剂处理后的葡萄霜霉病菌单斑分别保存于－20℃和－80℃两种低温下，120d后取出进行叶盘回接，常规补水保湿，第7d调查发病情况并比较两种低温处理对孢子囊存活的影响。

  1.2.3　不同保存时间对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  将三种保护剂处理后的萄霜霉病菌单斑均置于－80℃的超低温冰箱中保存，经过30、60、90、120、180 和 360 d 后取出进行叶盘回接，常规补水保湿，第7d调查发病情况并比较不同保存时间对孢子囊存活的影响。

  1.2.4　接种方法

  将不同保护剂、不同保存温度和不同保存时间储存的萄霜霉病菌单斑取出后，先在室温下缓慢解冻复苏后，再用血球计数板将孢子囊配置成8×105个/mL的悬浮液进行点滴接种，将采集回来的新鲜红地球健康叶片用蒸馏水清洗叶表面以除去灰尘和污物，在室温条件下晾干，用直径为15mm的打孔器将其打成叶盘，叶背朝上置于铺有湿润无菌滤纸的培养皿（直径为18cm）中，每处理10个叶盘，重复3次，每皿共计30个叶盘；用微量移液器在每个叶盘的中央滴加一滴20μL孢子囊悬浮液。接种后用保鲜膜密封培养皿，置于人工气候培养箱中，在18℃～22℃、湿度90%以上的黑暗处保湿培养24h后，用吸水纸吸干叶盘上残存的菌液，继续12h光暗交替培养7d。所有上述试验均以相同菌株的新鲜孢子囊悬浮液接种为对照。

  1.2.5　病情调查和统计接种以后每天观察发病情况，

  常规补水以保持叶盘湿润；接种7d后（叶片发病后且病情不再扩展），调查下列指标：叶盘总面积和病斑总面积。发病情况表示为发病面积的百分比，病斑面积越大，说明其保存的效果越好。使用DPS软件处理实验数据并进行显著性分析。发病面积百分率(%) =病斑总面积/叶盘总面积×100%

  2　结果与分析

  2.1　不同保护剂对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  试验结果表明，三种保护剂中以5%二甲基亚砜作保护剂在－80℃保存效果最好，30d后取出复苏回接，叶盘的发病面积百分率为69.32%，相比之下与对照没有显著差异，其次是单斑病叶液氮快速冷冻处理在-80℃保存，效果较差的是琼脂粉包埋置于－80℃保存，回接叶盘发病面积百分为48.32%，具有显著性差异。

  2.2　不同保存温度对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  试验结果表明，无论保存方法如何，在试验的两个低温条件下，葡萄霜霉病菌保存的致病效果在－80℃都是最好的。5%二甲基亚砜浸没保存于－80℃、单斑病叶液氮冷冻－80℃保存和琼脂粉包埋－80℃保存，120d后用孢子囊悬浮液进行叶盘回接，其发病面积百分率分别为58.56%、38.39%和31.97%，明显高于－20℃的保存温度。

  2.3　不同保存时间对葡萄霜霉病菌孢子囊存活的影响

  将三种保护剂处理后的葡萄霜霉病菌单斑均置于－80℃低温冰箱中，经过30d、60d、90d、120d、180d和360d后取出进行叶盘回接，结果表明，三种保护剂保存的葡萄霜霉病菌孢子囊均随着时间延长致病性明显降低了。其中以5%二甲基亚砜处理后在－80℃低温冰箱中的保存效果最佳，孢子囊的致病性能够保持360d以上且形态变化不大，采用该方法对上述不同保存时间的葡萄霜霉病菌孢子囊进行叶盘回接，其发病面积分别占叶盘面积的69.32%、64.58%、61.36%、58.56%、43.03%和22.96%，明显高于液氮和琼脂粉的保存效果。

  3　结论与讨论

  在本研究中选择了两种前人研究报道过的保护剂二甲基亚砜和液氮来保存葡萄霜霉病菌的孢子囊，针对葡萄霜霉病菌孢子囊的较长期保存，成功探索出一种新的保护剂琼脂粉，实验结果表明，用保护剂二甲基亚砜浸没处理后在－80℃保存效果最好，可以维持孢子囊的致病力达360d以上，明显高于在液氮和琼脂中的保存效果，这可以解决葡萄霜霉病菌因长期离体导致致病力下降的问题，其原因可能是由于二甲基亚砜有强烈吸湿性，能够降低细胞冰点，减少冰晶形成，减轻自由基对细胞损害，因此可用于用于除冰剂、涂料、各种乳胶的防冻剂、汽油、航煤的防冻剂，骨髓、血液、器官低温保存的防冻剂。

  二甲基亚砜具有一定的毒性，高挥发性浓度可引起头痛和头晕，它可以灼伤皮肤并引起皮肤瘙痒；液氮是一种使人窒息的气体，低温会对人造成冻伤，不可与皮肤接触；所以如果是短期保存（不超过90d）的话，推荐使用琼脂粉，实验室可就地取材，安全方便快捷，具体使用何种保存方法，可根据当地情况灵活控制。

  在本研究中，只研究了保存360d后孢子囊回接的致病性，以后将进一步的研究离体的葡萄霜霉病菌孢子囊在二甲基亚砜、液氮、琼脂粉或其他保护剂的保存时间的差异，致病力和最长的保存期限。