制汁葡萄品种改良岗位
孙婷 郭印山 李坤 刘镇东 李成祥 郭修武
葡萄果实大多具有浓郁的香气，这些香气形成了葡萄果实和其酿造的葡萄酒的风味特征，所含有的香气物质属于次生代谢产物（陈发兴等，2010）。葡萄果实在成熟过程中，各种挥发性化合物（如酯类、醇类、呋喃类化合物等）逐渐积累形成了香气物质，不同葡萄品种含有的挥发性化合物的种类、含量不同，构成其独特的香味。葡萄果实中的香气可划分为三种类型：玫瑰香型、中性香型和草莓香型（Yang et al. 2009）。玫瑰香型葡萄因其香甜的玫瑰味深受人们的喜爱；而草莓香型葡萄具有独特的狐香味，是葡萄果实和葡萄酒重要的品质性状，存在于美洲种或欧美杂种中。目前，葡萄香气物质的研究主要集中于玫瑰香味上，其香气成分及相应QTL位点控制的基因和转录因子已经被前人发现，而草莓香味（狐香味）研究仅局限于香气成分分析上。本试验以3种不同香气类型的6个葡萄品种为试验材料，通过不同香气类型葡萄品种香气物质的比较分析，找出草莓香型葡萄果实的特征香气成分，以便为深入开展葡萄草莓香型香气物质性状遗传机理研究及香型葡萄辅助选择育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试材为三种不同香气类型葡萄品种：草莓香型品种‘康可’、‘着色香’均具有浓郁的草莓香味；玫瑰香型品种‘玫瑰香’、‘87-1’具有浓郁的玫瑰香味；中性香型品种‘红地球’、‘双红’无明显香气。本试验的试材均保存于沈阳农业大学葡萄试验园内，采用常规管理。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集
于2017年和2018年在果实成熟期，分别采收各供试品种成熟葡萄果实，经液氮速冻后，置于-80℃冰箱中冷藏备用。
1.2.2 香气成分的萃取
香气成分采用顶空固相微萃取法进行萃取。葡萄果实室温化冻，称取200g，用榨汁机进行破碎、榨汁、离心后抽取8mL葡萄汁上清液（葡萄破碎后用3块纱布进行过滤）置于已加入磁力转子和3g NaCl的20mL的顶空瓶中，快速加盖密封。将顶空瓶放在恒温搅拌器上加热，预热8-10min，将SPME萃取头插入到样品顶空瓶中，伸出石英纤维在距离液面1-2cm处进行萃取。磁力转子转速设为950r•min-1，在60℃下吸附40min，过程中保证样品不沸腾。吸附完成后把石英纤维抽回，缓慢抽出萃取头，直接插入气相色谱的进样口，于250℃解析5min。
1.2.3 香气成分的检测
香气采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对成分进行分析。气相色谱条件：色谱柱：VFWaxms毛细管柱( 长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25um)，载气为氦气，流速1.1 ml•min-1，不分流模式进样。进样口温度：250℃，解析5min；升温程序：初始温度50℃保持3min，以每分钟5℃的升温速度升至90℃，保持1min，以每分钟3℃的升温速度升至120℃，保持2min，以每分钟5℃的升温速度升至210℃，保持3min，共运行45min。
质谱条件：GC-MS传输线温度250℃，EI离子源温度为230℃，电子能量为70eV，光电倍增管电压为350V，质量扫描范围为m/z30-500amu。
1.3 数据统计分析
定性定量分析：将采集到的质谱图在NIST Ⅱ谱库中进行检索，并根据检索得到的质谱信息确定香气成分，采用峰面积归一法计算相对定量，并用目标香气的标准品制备标准曲线进行定量分析。
香气活性值（OAV）分析：文献查阅香气物质的香气阈值，利用该物质的定量结果与阈值的比值计算各物质的OAV，OAV大于1的香气物质即被定性为对葡萄香气具有贡献的活性香气成分（Francis &Newton, 2005）。数据采用Excel和origin 2018进行统计分析。
2 试验结果
2.1 不同香气类型葡萄果实香气
物质成分定性分析对不同香气类型葡萄果实香气成分采用峰面积归一法进行定性并进行汇总，确定了不同香气类型葡萄检测到的挥发性化合物（表略）。结果表明，在不同香气类型葡萄品种两年中共检测到51种挥发性化合物。其中萜类化合物8种，分别为D-柠檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、3,7-二甲基-1,5,7-辛二烯-3-醇、ɑ-萜品醇、柠檬醛、橙花醇和香叶酸；酯类化合物22种，分别为乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、戊酸乙酯、反式-丁烯酸乙酯、3-己烯酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、S-3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-羟基己酸乙酯、水杨酸甲酯、水杨酸乙酯、丁酸丁酯、2-甲氧基苯甲酸甲酯、2-甲氧基苯甲酸乙酯、十六酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯和邻氨基苯甲酸乙酯；其它类化合物21种，分别为反式-2-己烯醛、壬醛、2,4-己二烯醛、癸醛、苯甲醛、5-甲基-2-糠醛、4-异丙烯基甲苯、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、对甲基苯乙酮、大马士酮、萘、麝香草酚、苯酚、丁香酚、庚酸、苯乙醇、反式-2-己烯酸、辛酸、壬酸、正癸酸和棕榈酸。
‘康可’作为典型的具有草莓香味（狐香味）的葡萄品种，果实中共检测到44种化合物，其中苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯、反式-丁烯酸乙酯、丁二酸二乙酯、2-甲氧基苯甲酸乙酯、3-羟基己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、S-3-羟基丁酸甲酯、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮等12种化合物仅在‘康可’中检测到。‘着色香’品种中共检测到34种化合物，‘玫瑰香’和‘87-1’分别检测到19种和28种化合物，‘红地球’和‘双红’中分别检测到24种和16种化合物。‘康可’品种中含量最高的化合物是邻氨基苯甲酸甲酯（2017和2018 两年相对含量分别为46.85 %和32.72 %），而‘着色香’中邻氨基苯甲酸甲酯（两年相对含量分别为29.95 %和15.18 %）和反式-2-己烯醛（两年相对含量分别为19.20 %和19.20 %）含量较高。玫瑰香型品种中主要化合物为萜类化合物（如芳樟醇）和反式-2-己烯醛（‘玫瑰香’中两年相对含量分别为3.20 %和26.20 %，‘87-1’中两年相对含量分别为29.57 %和20.10 %）。中性香型品种中含量最高的是反式-2-己烯醛（‘红地球’中两年相对含量分别为71.43%和90.09 %，‘双红’中两年相对含量分别为54.56 %和92.88 %）。
2.2 不同香气类型葡萄果实香气
物质成分定量分析通过上述香气物质定性分析发现，D-柠檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、3,7-二甲基-1,5,7-辛二烯-3-醇、ɑ - 萜品醇、柠檬醛、橙花醇、香叶酸等萜类化合物在玫瑰香型品种中检测到且含量较高，酯类物质主要存在于草莓香型品种中。通过对不同香气类型的挥发性化合物比较，初步筛选出在草莓香型品种中含量较高或是特有物质共6种，分别为对甲基苯乙酮、丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯。然后，通过目标香气的标准品制备标准曲线对不同香气类型品种的6种香气物质进行了定量分析。从表1定量分析结果可以看出，这6种香气物质在玫瑰香型和中性香型品种中物质含量较低（均小于15μg•kg-1），而草莓香型品种中含量明显较高。香气物质的含量和众多因素有关，两年中6种香气物质含量虽有差异，但趋势基本相同。在草莓香型品种中，纯美洲种的‘康可’品种，有5种香气物质含量两年均为最高，如邻氨基苯甲酸甲酯作为典型的狐香味香气物质，‘康可’品种中的含量最高（两年分别为4100.66μg•kg-1和2281.55μ g • k g - 1） ， 而欧美杂种‘ 着色香’ 中较低（ 两年分别为3 6 6 9 . 5 8 μ g • k g - 1 和1628.09μg•kg-1），仅1种香气成分对甲基苯乙酮的含量在‘康可’和‘着色香’相反（‘康可’中两年含量分别为67.69μg•kg-1和1110.75μg•kg-1，‘着色香’中两年含量分别为808.00μg•kg-1和2092.00μg•kg-1）。
2.3 草莓香型葡萄果实特征香气
物质成分OAV分析采用香气活性值（OAV）对活性香气物质及其特征香气成分进行鉴定分析，结果见表2。由表2可以看出，丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、对甲基苯乙酮和丁酸乙酯五种香气物质OAVs在‘康可’和‘着色香’中均大于1，乙酸乙酯的OAVs只在‘康可’中大于1，而在‘着色香’中大于0.1。故丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、对甲基苯乙酮、丁酸乙酯5种香气物质是‘着色香’的特征香气成分，乙酸乙酯是‘康可’中的潜在特征香气成分，而对甲基苯乙酮、丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯6种香气物质是‘康可’的特征香气成分。因此，综合认为草莓香型葡萄果实特征香气物质（化合物）为丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、对甲基苯乙酮和丁酸乙酯。
3 小结
（1）对3种香气类型6个葡萄品种采用峰面积归一法进行果实香气物质分析，两年中共检测到51种香气物质，其中萜类化合物8种，酯类化合物22种，其它类化合物21种。
（2）经过比较筛选出6种化合物（分别为对甲基苯乙酮、丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯）进行了定量分析，发现草莓香型品种中的含量均明显高于玫瑰香型和中性品种。
（3）通过OAV分析认为对甲基苯乙酮、丁香酚、邻氨基苯甲酸甲酯、邻氨基苯甲酸乙酯和丁酸乙酯5种化合物是草莓香型葡萄的特征香气成分。