熟期调控岗位

朱明涛 余 俊 杨国顺

  核黄素，又称维生素B2，是一种光敏剂，可在光照下产生活性氧(Deng et al., 2014)。有研究发现，外源喷施核黄素可显著影响植物抗氧化代谢，增加植物内活性氧含量(Taheri and Tarighi, 2010)，而活性氧能够促进果实成熟的研究已经有很多报道(Jimenez et al., 2002; Qin etal., 2009 )。本试验正是基于以上机理开展了核黄素处理促进刺葡萄早熟性研究。

  1　试验材料与方法

  1.1　材料及处理方法

  本研究试验地点位于湖南农业大学干杉基地，以6年生的篱架栽培刺葡萄为试材，花后50d用浓度0.5mM•L-1核黄素在晴天上午12点左右浸果处理，花后60d进行第 2次处理，共处理 2次；每个处理设3 次重复，每次重复 3 株树，对照为清水。在第一次处理后每隔10d取 1 次样，总共取样6次。样品采集时每处理随机选取果穗，采集状态一致，有代表性无病虫害果粒，3 次重复，每个重复10粒。果实采收后立即用锡箔纸包裹后置于液氮中保存。记录处理后果实发育物候期。

  1.2　测定指标

（1）H2O2 and O2– 测定

  H2O2含量的测定具体参考Deng等（2014）的方法；O2–的测定参考Li等（2012）的方法。

  （2）SOD and CAT活性的测定

  酶的提取采用Deng等（2014）的方法，SOD和CAT活性的测定参考Chen和Cheng （2003）的方法。

  （3）花色苷和可溶性固形物含量的测定

  花色苷的提取采用超声波辅助法，具体参考Liang 等. (2011) ，总花色苷检测采用pH示差法，详见Chen 等 (1991)。可溶性固形物含量采用PAL-1 数显糖度计测定。

  （4）PAL （苯丙氨酸解氨酶基因）和LOX （脂氧合酶基因）表达量检测

  RNA提取使用百泰克多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）, cDNA的获得用ReverTra Ace qPCR RT MasterMix 反转录试剂盒（TaKaRa，日本） ，qRT-PCR使用R o c h eSYBRGreen试剂盒（Roche，美国），利用Primer 5.0 设计qRTPCR引物。

  2　结果与讨论

  2.1　核黄素处理对刺葡萄果实成熟期的影响

  核黄素浸果处理刺葡萄10d后（图1），果实开始出现少部分转色，而对照果实还处于转色前期，在处理后30d，刺葡萄果实已经大部分变为红色，部分转变为紫色，而对照只是开始出现红色，还有个别果实处于绿色状态。在处理50d后，果实已经完全变为紫色，对照大部分处于深红色，只有少部分为紫色。表1位核黄素处理对刺葡萄果实成熟期的影响，由表1可知，刺葡萄经过核黄素浸果处理后，转色期要早于对照9d左右，成熟期早于对照7d左右，这说明核黄素浸果处理能够促进刺葡萄果实的提前成熟。

  2.2　核黄素处理对刺葡萄果实花色苷和可溶性固形物含量的影响

  花色苷和可溶性固形物含量的升高是葡萄果实成熟的标志(Koshita, et al., 2011)。从我们的研究结果可知（图2），与对照相比，核黄素处理后的果实内花色苷（图2A）和可溶性固形物含量（图2B）的快速积累期早于对照，但最终含量与对照差异不显著。

  2.3　核黄素处理对刺葡萄果实活性氧积累的影响

  果实成熟是一种氧化现象，常伴随着活性氧的显著增加，尤其是O2-和H2O2的积累(Warm andLaties 1982; Tian et al., 2013)。O2-和H2O2是最重要的活性氧分子，对诱导果实成熟至关重要(Tian et al.，2013)。核黄素具有过氧化作用，这种作用会影响活性氧的产生，Taheri和Tarighi(2011)报道了甜菜经核黄素处理后产生活性氧爆发。Li等(2012)在梨果实试验中也发现了类似的结果。我们的研究结果表明上述研究相符合，证实核黄素处理可以诱导葡萄果实果中O2-和H2O2含量的增加(图3)。

  2.4　核黄素处理对刺葡萄果实抗氧化酶活性的影响

  SOD和CAT分别是分解O2-（超氧阴离子）和H2O2（过氧化氢）的重要酶。为了研究核黄素促进刺葡萄早熟的机理，我们测定了这两个酶的活性，结果表明，与对照相比，在处理后各个时期内果实SOD和CAT活性低于对照(图4).与我们研究类似，Deng等(2014)发现大量核黄素处理烟草后会降低抗氧化酶活性。核黄素处理植物后导致抗氧化酶活性降低的原因可能是因为其产生的高水平活性氧抑制了O2-和H2O2酶的活性。

  2.5　核黄素处理对PAL 和LOX 表达量的影响

  PAL （苯丙氨酸解氨酶基因）和LOX （脂氧合酶基因）是与葡萄成熟密切相关的两个基因。PAL基因是花色苷合成途径的起始基因，研究表明，增强PAL 的表达可以促进花色苷的合成，其表达量的高低与葡萄花色苷的积累密切相关(Qzeki et al.，2010)。Taheri和Tarighi(2010)发现核黄素处理水稻后能够强烈诱导PAL 和LOX 基因的表达，与前人研究结果类似，我们发现核黄素处理可以提前葡萄果皮内PAL 基因表达(图5A)和花色苷含量的增加 (图2A)。

  LOX 在植物的生长发育和成熟过程中起着重要的作用，对植物的机械损伤、疾病和昆虫感染等具有重要的抗性(Heitz et al., 1997)。在高等植物中，LOX 与乙烯、茉莉酸和脱落酸的合成有关，而脱落酸和茉莉酸对葡萄果实成熟都具有促进作用 (Parry, 1991)。在我们的试验中发现，核黄素处理后，果实内LOX 基因上调表达(图5B)，成熟期提前了一周左右(表1)。相反，如果LOX 基因表达受到抑制，果实的成熟期也会推迟，Lin等(2018)发现用异丙硫醚处理葡萄果实后，LOX 基因表达受到抑制 ABA合成减少，葡萄果实成熟期延长。

  3　结论

  本研究发现核黄素处理具有促进刺葡萄早熟的作用，其机理可能是核黄素产生的活性氧抑制了果实内抗氧化酶活性，使果实果实内活性氧增加，同时促进了成熟相关的PAL 和LOX 基因的提前上调表达，从而使刺葡萄提前成熟。