病毒病防控岗位
周俊 范旭东 胡国君 任芳 张尊平 董雅凤
葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleafvirus, GFLV）可引起葡萄扇叶病，导致葡萄产量降低、品质下降，并且缩短葡萄园的经济寿命。我国对葡萄扇叶病毒的研究较少，目前所用的检测技术之灵敏度和稳定性有待进一步提高，且尚未获得GFLV中国分离物的全基因组序列，其遗传变异状况不明。因此，本研究旨在建立稳定、快速、灵敏的GFLV检测技术，并明确我国GFLV分离物的分子特点。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用样品为休眠枝条，大部分采自“国家落叶果树脱毒中心”样品保存圃（辽宁兴城），少量样品通过外寄方式获得。根据GenBank登录GFLV常见株系的MP和CP基因序列保守区，设计用于GFLV巢式PCR扩增的简并引物（见表1），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 方法
（1）ELISA检测方法
GFLV ELISA检测结果为本实验室多年检测结果统计所得，其检测方法如下：初春采集葡萄嫩叶0.5g加入2.5ml提取缓冲液研磨，取100μL加入已包被抗体的酶联免疫板中，加盖4℃下孵育过夜之后每孔加入适宜浓度的酶标抗体稀释液100μL，37℃下孵育2小时；2小时后，加入100μL新配制的底物溶液，室温下黑暗孵育1小时；最后肉眼观察颜色反应，并用酶联检测仪测定450nm 吸光值。
（2）巢式RT-PCR
采用柱式方法提取RNA：取约50mg葡萄组织与1mL 裂解液研磨成匀浆；匀浆离心后，取上清液600mL与300mL的无水乙醇混合，加入吸附柱中（购自北京艾德莱生物科技有限公司）；多次漂洗后，用50mL无RNA酶的水洗脱总RNA；取5mL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，合格的总RNA溶液立即用于反转录或者保存于-70℃超低温冰箱中备用。
逆转录在1.5mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水9.0mL、6 bp随机引物（上海生工生物工程技术服务公司合成）1.0mL、总RNA 5.0mL后，离心混匀95℃水浴5min，冰上放置5min。再依次加入5×M-MLV Buffer 5.0mL、2.5mmol/L dNTPs 3mL、200 U/mL M-MLV 0.5mL、灭菌纯水1.5mL，37℃ 水浴10min，42℃水浴50min，72℃水浴5min，合成的cDNA立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。巢式PCR第一轮反应体系为25mL：10×Taq buffer 2.5mL，dNTPs（2.5mmol/L）2.0mL，10mmol/L引物1 0.5μL，10mmol/L引物2 0.5μL，DEPC水17.25mL，5U/mL Taq 0.25μL，cDNA2μL；巢式第二轮PCR将Taq量降为0.15μL，cDNA量降为1μL，减少的量用DEPC水补足。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后一轮循环后72℃延伸10 min。
（3）GFLV基因克隆、测序及分析
PCR反应结束后，取产物5μL用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增获得的目的DNA片段采用北京艾德PCR Fragment RecoveryKit回收纯化，取4mL回收产物与pMD18-T试剂盒中的pMD18-T 1mL和Solution 4mL混匀后，于16℃连接1h即用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行菌液培养，通过PCR鉴定获得阳性重组质粒，随机选择其中3-6个阳性克隆委托北京诺赛基因组研究中心进行测序。
将所有G e n B a n k 上已登录的GFLV分离物和本研究获得的GFLV分离物采用MegAlign程序（DNASTAR lasergene v7.1.0软件包） 进行多序列比对， 并用MegAlign程序中Clustal W分析GFLV分离物的同源性；多序列比对采用Clustal Omega进行（http://www.clustal.org/omega/）。重组事件使用RDP 4.22程序中的七个重组检测程序（RDP，BOOTSCAN，SISCAN，SEQ，GENECONV， LARD和MAXCHI）进行检测。系统进化树构建使用程序Mega 6.06软件中的Maximum Likelihood方法进行构建，
2 结果
2.1 GFLV检测结果
采用ELISA和巢式RT-PCR方法对来自全国13个省（市、自治区）的142株葡萄样品进行检测。巢式PCR第一轮扩增引物FL-MP1A/B和FL-CP1A/B仅检测出两个阳性样品，巢式PCR第二轮扩增引物FLMPn1A/B检出35个阳性样品，而巢式PCR第二轮扩增引物 FL-CPn1A/B检出23个阳性样品；另外，FLCPn1A/B检出23个阳性样品中，有20个FL-MPn1A/B引物也检出阳性，重复检出率为87%；因此，综合两套巢式PCR引物的检测结果，巢式PCR共检出阳性样品38个，检出率36.8%（表2）。以上巢式PCR检测结果表明，巢式PCR检测不仅具有比普通PCR更高的灵敏度，而且具有较高准确度。ELISA检出阳性样品54个，检出率38%（表2）；比较ELISA与FL-MPn1A/B、FL-CPn1A/B检出阳性样品，发现FL-MPn1A/B、FL-CPn1A/B检出阳性样品中，分别有29、23个样品 ELISA检测为阳性，总共32个巢式PCR阳性样品 ELISA检测也为阳性，另有6个巢式PCR检测为阳性的样品ELISA检测为阴性。
2.2 GFLV 在我国的发生与分布
对来源于13个省（市、自治区）的142株葡萄样品检测结果显示，来源于7个地区的60个样品为阳性，带毒率为42.3%（表2）%。其中，辽宁72.6%（45/62）、山东15.2%（4/33）、北京15.4%（2/13）、新疆37.5%（3/8）、宁夏12.5%（ 1 / 8 ） 、河北20%（1/5）、天津75%（3/4）。以上结果表明，GFLV在我国分布较广且发生较为普遍。
2.3 我国GFLV分离物遗传多样性分析
为了解我国GFLV分离物多样性，本研究分别回收FL-MPn1A/B、FL-CPn1A/B目的条带，并进行克隆、测序和比对分析，结果获得39条2BMP独特序列和22条2CCP序列，并将其登录NCBI GenBank。每个样品各克隆间序列比对结果显示，大部分2BMP序列和所有2CCP序列相似性高于98%，但是部分样品克隆间2BMP序列相似性低于98%，如LN-QQWH各克隆间相似性为96.4%–99.8%、LN-ZF各克隆间相似性为96.6%–99.8%、LN-SDHN各克隆间相似性为95.8%–99.8%。
以上结果表明，在部分样品中2BMP基因比2CCP基因变异稍高。不同样品间分离物多序列比对结果显示，无论是2BMP基因还是2CCP基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性均高于95%。此外，我们还将本实验室获得的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中相应的序列进行比对，结果2BMP核苷酸和氨基酸序列相似性分别为78.3-86.6%和89.3-96.4%，2CCP核苷酸和氨基酸序列相似性分别为74.8-83.3%和81.4-91.4%。从该结果可以看出，本实验获得的我国GFLV分离物与所有已发表GFLV分离物差别较大，有其独特性；但由于该差异并未达到线传多面体病毒属划分新种的 标准，因此，本研究获得的中国GFLV分离物并不是一个新种，只是与先前报道GFLV分离物不同的变异株。
2.4 我国GFLV分离物重组和进化树分析
将本研究中得到所有GFLV分离物与已在GenBank登录分离物的相应序列进行重组分析，结果在本研究获得的分离物中未发现重组事件。此外，选取本研究得到的有代表性的39条2BMP序列、22条2CCP序列分别和GenBank有代表性的76条2BMP序列、68条2CCP序列用软件MAGA 6.06进行进化树分析，结果发现无论是2BMP还是2CCP进化树，中国GFLV分离物均形成了一个单独的组，是一个独立的亚群（图1）。
图1 中国GFLV分离物进化树A: GFLV MP序列分离物进化树；B: GFLV CP序列分离物进化树
并且从2BMP进化树中可以看出，中国GFLV分离物同伊朗分离物和大部分斯洛文尼亚分离物聚集一个独立的集群，明显不同于来自法国、意大利和美国的分离物，它们分散于不同的谱系中。而在2CCP进化树中，伊朗分离物和大部分斯洛文尼亚分离物并没有形成一个独立的集群，而是像法国、意大利和美国一样分散于不同的谱系中。但是无论在何种情况下，系统发育分析都表 明中国与意大利、法国、美国分离物间的进化关系明显不同。
2.5 GFLV种群间的遗传分化和基因漂移
为确认进化树分析的结果，使用DnaSP 5.10对本实验获得的分离物与其他国家的分离物进行遗传分化和基因漂移检测，遗传分化使用Ks*、Z*、SNN进行统计测试，而种群间基因漂移通过Fst（等位基因在种群漂移频率的标准化方差的绝对值）进行估计。其中，Fst的绝对值为0-1分别种群间完全相同和完全不同，通常Fst的绝对值大于0.33表明基因漂移不频繁，而Fst的绝对 值小于0.33表明基因漂移频繁。如表3所示，来自中国和其他国家的GFLV种群间KS*、Z*、SNN 3项测试的值均为0.0000，而且Fst值大于0.33，所以表明种群间遗传分化显著、基因漂移罕见。这再一次证明本实验获得的中国GFLV分离物与其他国家分离物间进化关系明显不同，具有其独特的进化轨迹，这可能是因为地理隔离导致的。