种质资源收集与评价岗位

李晓鹏 樊秀彩 张颖 姜建福 刘崇怀

  摘　要：赤霉素在葡萄无核化生产起着重要作用，研究赤霉素导致无核的机理具有重要意义。本研究以醉金香葡萄为实验材料，研究了赤霉素对葡萄花粉的影响，结果表明，赤霉素可诱导花粉细胞内H2O2含量升高，并且降低花粉活力，离体培养的花粉管生长速度减缓，此外，赤霉素促进了花粉原生质体质膜钙通道的开启，引起细胞钙内流的变化。因此推测，赤霉素引起的花粉活力降低是由钙信号触发的一系列级联反应引起。

  无核是鲜食和制干葡萄的优良性状之一，无核葡萄具有较高的商业价值，在国内和国际市场上占据重要地位，具有良好的市场前景，颇受葡萄加工产业的欢迎和广大消费者的青睐，也给生产者和加工者带来了巨大的经济效益。

  目前，生产上培育无核葡萄有两种主要途径：一是，直接培育或引进无核品种；二是，人工诱导产生无核果实。但是，因我国无核葡萄品种比例较小，育种进程又较慢，无核葡萄的生产远远不能满足市场的需求，而从国外引进的无核品种适应性较差，这使得有核葡萄品种的无核化成为生产上培育无核葡萄的主要途径。生产上主要通过外源赤霉素（Gibberellin, GA）来诱导葡萄刺激型单性结实（以下简称GA诱导葡萄单性结实）使其无核化。

  赤霉素是植物生长发育过程中的主要激素，也是开花、座果及果实发育所必需的激素。目前，在果树方面，赤霉素在葡萄上的应用最为广泛，主要涉及到葡萄无核化栽培、提高坐果率、促进无核葡萄品种果实的生长、增加穗重、提早成熟和打破休眠等方面，其中葡萄无核化栽培是其最主要的应用方面。

  前人研究表明，赤霉素对葡萄‘佳利酿’（Carignane）的花粉具有杀伤作用；赤霉素主要抑制其花粉萌发同时诱导其胚囊不能正常受精从而形成无核果，玫瑰香品种却主要是使其受精胚退化而无籽，而京亚、红富士品种主要是诱导其花粉发芽率降低从而影响授粉受精。赤霉素（GA3）诱导‘醉金香’葡萄果实无核的效果非常显著，其机理研究也倍受关注，但这些研究主要集中在生理方面。但到目前为止赤霉素作用机理尚不太清楚，本研究从葡萄花粉入手，研究赤霉素处理对花粉的影响，也有助于更科学地指导葡萄无核化生产，具有重要的理论与生产意义。

  1　材料与方法

  1.1　实验材料

  实验所用材料取自中国农业科学院郑州果树研究所国家果树果树种质郑州葡萄圃。醉金香葡萄花前2天用50mM赤霉素（GA3）溶液处理花序，花序浸液15s，对照清水处理15s；处理结束套纸袋，盛花期采集花粉备用。

  1.2　生化试剂

  实验所用试剂采购自Sigma公司。

  1.3　花粉活力鉴定

  将采集的花粉放于载玻片，加1-2滴0.5%TTC溶液，混合均匀加盖盖玻片，玻片置于37%恒温箱30min，显微镜观察。

  1.4　花粉电镜观察

  将保存的花粉粘于电镜样品台上，在JFC-1600型离子溅射仪内喷金5-10min，加速电压为15kV，在JSM-6300LV型扫描电子显微镜下观察花粉的形态、表面纹饰特征、表面孔穴分布情况并拍照。

  1.5　花粉培养

  葡萄花粉在BK培养基中萌发和生长。BK培养基包括0.55mMCa(NO3 ) 2，1.60mM H3BO3，1.60mM MgSO4， 1.00mM KNO3，400mM蔗糖，5mM 2-吗啉乙磺酸，Tris调节pH6.0-6.2。花粉在25℃，100%湿度条件下预水合1h，暗培养，在光学显微镜下观察花粉管生长情况。

  1.6　花粉原生质体的分离

  将经预水合后的花粉在BK培养基中解育30min，用培养基清洗两次，然后在酶液（1%（w/v）离析酶R-10，2.0%（w/v）纤维素酶R-10，0.7%（w/v）裂解酶Y-23，1%牛血清蛋白)中32℃下孵育2.5h。胞外液（0.2mM葡萄糖，10mM CaCl2，5mM MES，山梨醇调节渗透压至800mosmol•L-1，pH用Tris调节至6.0）清洗酶解后的原生质体2次。

  1.7　全细胞膜片钳实验

  应用全细胞和单通道膜片钳技术研究花粉原生质体超极化激活的钙通道的特性，全细胞记录时，封接电阻应高于1.5GΩ，将膜电位锚定在0mV，记录方式为渐进式。数据的采样频率2kHz，并在0.5kHz下过滤。

  2　结果与分析

  由图1可知，‘醉金香’葡萄花序经50ppm的GA3处理后，采集花粉进行TTC染色观察、电镜观察和花粉离体培养。结果发现，经GA3处理后，TTC染色表明处理后的花粉（图1-b）染色程度较低，表明TTC不能充分染色，花粉生活力在赤霉素处理下明显降低；电镜可观测到花粉条纹明显，条纹间距小，弯曲，有少量纹孔，处理后的花粉与对照花粉表面形态变化不大；对花粉进行培养，发现赤霉素处理后，花粉萌发率低，花粉管短，与对照相比有明显区别，说明赤霉素处理在离体情况下影响花粉的萌发。

  花粉活力的降低离不开花粉细胞内部氧化还原平衡的变化，氧化还原的变化伴随着H2O2含量的变化。由图2可以看出，赤霉素处理后，赤霉素处理的‘醉金香’花粉原生质体荧光强度高约15.1 A.U.，在对照原生质体中滴加赤霉素最大荧光强度提高了近1.3倍，结果可知，赤霉素可引起花粉细胞内部H2O2含量，导致了花粉氧化还原平衡得到破坏。

  钙离子作为植物细胞信号转导的重要第二信使，在调控植物花粉管生长发育及代谢反应具有重要的作用。通过全细胞膜片钳测试质膜钙电流的大小，研究GA3对花粉质膜钙通道的调控特性。‘醉金香’花粉原生质体经赤霉素刺激后产生了内电流，这说明赤霉素处理使胞外液中的Ca2+流入原生质体，明显促进了钙通道的开启（图3），这些大量的钙内流可能诱发花粉内部信号级联反应，导致花粉活力降低。

  3　讨论

  葡萄单性结实按其是否完成授粉、受精分为天然单性结实、刺激型单性结实、伪单性结实三种类型。天然单性结实是指在自然条件下子房不经过授粉受精而发育成果实。而刺激型单性结实是指子房在花粉、外界环境条件（主要是低温）或外源激素的刺激下不经过受精而发育成无籽果实的现象。花粉或低温刺激也是通过激发产生生长素或赤霉素从而诱导单性结实的。

  事实上，上述两种单性结实主要是由于其本身或刺激造成促进生长的激素物质含量较高才使得果实能够正常座果、发育。伪单性结实是指经过传粉受精，但由于各种原因，胚只稍稍发育就转向败育，而子房或花托等部分可继续发育，从而形成无籽果实的现象。与单性结实果实相比，伪单性结实果实是因为在胚胎发育早期促进生长的激素物质含量很低而抑制生长激素物质含量很高，从而严重抑制了早期或中期合子胚的发育，形成种子败育型的无籽果实。因此，从生理上说，激素是影响单性结实的最主要因素。

  本实验研究了赤霉素处理对醉金香花粉活力的影响。结果表明，花前用赤霉素处理葡萄可降低花粉的生活力，这与前人的研究一致，花粉的萌发率和花粉管生长速度均受到抑制。通过电镜观察，赤霉素对花粉的形态变化没有影响。此外，本实验还研究了赤霉素对花粉H2O2含量的影响，H2O2含量直接影响花粉内部氧化还原平衡。赤霉素处理导致花粉内部H2O2含量升高，表明了处理后花粉活力的降低与H2O2含量有关。不同信号分子在信号通路的上下游关系是细胞信号转导研究的重要内容。钙是植物细胞的重要的信号分子，它可与多种信号分子相互作用，参与多个信号途径的调控。赤霉素处理后，花粉原生质体细胞内自由钙浓度升高，说明赤霉素处理能促进质膜钙通道的开启，胞内自由钙浓度可能在花粉活力起重要作用。

  总之，本实验结果证明，赤霉素显著影响花粉活力，可导致花粉内部氧化还原平衡的变化，从而影响花粉生活力和萌发；花粉质膜有超极化激活的钙通道，该通道的活性与花粉的活力显著相关。因此，赤霉素可能调节花粉细胞钙梯度变化，从而引起细胞内部的级联反应，导致细胞内部平衡被打破，花粉的活力降低。