左家综合试验站

赵滢 艾军 杨义明 刘迎雪 范书田

　　山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄属中最抗寒的一个种。休眠期枝条的抗寒性具有较高的遗传力，是葡萄抗寒育种的重要亲本材料。田间观察发现不同山葡萄种质抗寒能力存在差异，建立快速、准确、稳定的抗寒性评价方法对山葡萄种质资源进行系统评价，发掘优异种质资源，对山葡萄种质资源在抗寒育种领域的高效利用具有重要意义。本研究建立了TTC染色及图像可视化评估配合Logistic方程鉴定山葡萄种质抗寒性的方法，具有简便、准确、重演性强等优点，为山葡萄抗寒评价研究及抗寒育种材料选择提供了有效的鉴定方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验材料

　　40份供试材料采自国家果树种质山葡萄圃，试材包括纯种山葡萄种质38份，休眠期枝条于2017年1月剪取；山欧杂种‘北冰红’和‘左优红’2份，为对照品种，其休眠枝条于深秋10月底未埋土防寒前剪取，然后放入冷库中待处理。所用枝条均为长势和粗度相对一致（约0.8 cm粗）且健康成熟的1年生枝条，架面南侧1.0 ~1.8m范围内取样。每份种质取50根枝条，每根60cm长。

　　1.2　材料处理

　　将采集的枝条带回实验室，剪成20 cm长的小段，装于自封袋中，－15 ℃冰箱中贮藏。使用高低温交变试验箱（型号：GDJW-225，北京雅士林试验设备有限公司）对枝条进行低温处理，处理温度为－20、－25、－30、－35、－40、－45、－50 ℃，按4.0 ℃/h的速度降温，至设定温度后保持12h，再按4.0 ℃/h的速度升至20 ℃后，取出静置2 h。去除表皮，避开芽眼，以备用于抗寒性评价及指标测定等研究。

　　1.3　TTC染色及图像可视化评估鉴定枝条抗寒性

　　不同低温处理后，从各枝条上剪取0.5 cm小段，每份种质取10段，放入10 mL 0.5 % TTC染液中，于30 ℃恒温培养箱中避光染色4 d后取出，然后将枝段纵切，蒸馏水冲洗3次，滤纸吸干水分，放入连有WinRHIZOTM图像分析软件的LA2400扫描仪中对枝段纵切面进行扫描；利用图像分析软件计算纵切面染色面积并确定染色等级；同时根据染色等级计算染色指数，以染色指数反映各试材的受冻程度。染色分级标准如下：4级，纵切面90 %以上的面积呈红色；3级，纵切面70 % ～ 90 %的面积呈红色；2级，纵切面40 % ～70 %的面积呈红色；1级，纵切面5 % ～40 %的面积呈红色；0级，纵切面5 %以下的面积呈红色。染色指数=Σ（染色级别×枝段数）/（4×枝段总数）。

　　根据不同山葡萄种质各低温处理下枝段染色指数的变化情况，配合Logistic方程建立回归方程，拟合温度拐点来确定其低温半致死温度（LT50）。

　　1.4　水培萌枝率调查

　　不同低温处理的每份试材选取带芽眼的枝段共30根，10根为1次重复，共3次重复。培养期间每5天换一次水。萌枝率=（萌芽枝数/总枝数）×100 %。

　　2　结果与分析

　　山葡萄枝条经不同低温处理并TTC染色后，图像可视化评估所求得的染色指数与冷冻温度呈典型的倒‘S’型曲线，且能将抗寒性不同的种质的抗寒性有效分开（图1），说明可以利用非线性回归分析结合Logistic 方程拟合温度拐点，确定低温半致死温度（LT50）。

　　采用TTC染色及图像可视化评估配合Logistic方程鉴定了38份山葡萄种质及2份山欧交种品种的抗寒性，结果表明山葡萄种内不同资源的抗寒性存在较大差异，半致死温度越低抗寒性越强，低温半致死温度（LT50）处于－34.47 ℃～－39.41 ℃之间。山欧杂种的抗寒能力相对较弱，‘左优红’和‘北冰红’低温半致死温度分别为－29.87℃和－29.75 ℃（表1）。

　　不同低温处理下枝条的水培萌芽情况与TTC染色图像可视化评估配合Logistic方程得到的低温半致死温度（LT50）较为相符，抗寒性较强的山葡萄种质‘双优’在－35 ℃的条件下仍有22.00 %左右的萌芽率，而‘北冰红’在－30 ℃的条件下萌发率为0.00 %。说明TTC染色图像可视化评估配合Logistic方程鉴定山葡萄种质抗寒性具有一定的可行性。

　　3　结论

　　TTC染色法是进行植物组织活力检测的经典方法，但由于该方法的染色程度量化评估较为困难，多用于定性评价。本研究采用LA2400扫描仪结合WinRHIZOTM图像分析软件进行染色值的量化分析，较好地解决了染色程度的量化问题，使TTC染色法这一经典方法用于山葡萄枝条的抗寒性评价。TTC染色及图像可视化评估配合Logistic方程鉴定山葡萄种质的抗寒性，具有快速、准确、操作简单的特点。