酿酒微生物岗位

刘延琳团队

 

　　摘　要：目的：建立一种快速从酿酒酵母突变库中筛选出低产乙醇酵母菌株的方法。方法：以转录因子spt15随机突变酿酒酵母文库为研究模型，以高生物量产率作为低产乙醇酿酒酵母的筛选标记，利用24孔板对spt15突变酵母文库进行初筛，对初筛获得的目标菌株，再以乙醇产量作为筛选标记进行复筛，最终获得乙醇合成能力较低且生物量较高的酿酒酵母菌株。

 

　　结果：(1) 利用易错PCR技术构建了spt15随机突变文库，并将其转化至酿酒酵母YS59（Saccharomyces cerevisiae YS59），获得了S. cerevisiae YS59 spt15突变文库；(2)经过初筛，获得了与对照菌株相比，生物量产率≥70%的14株S. cerevisiae YS59spt15突变菌株；(3)通过复筛，筛选出了编号712的低产乙醇突变菌株，其乙醇合成量降低了28.1%；(4)通过序列比对，发现spt15-712上有9个碱基发生了突变，分别是A161G、T426C、T462C、T493A、A506G、T546C、T622C、T658C、A750T9。结论：成功建立了一种高通量筛选低产乙醇酿酒酵母的方法，并利用这种方法筛选出了乙醇合成量降低28.1%的低产乙醇突变菌株。

 

　　关键词：酿酒酵母；生物量产率；低产乙醇；spt15；突变

 

　　随着全球气候的变暖，葡萄的糖含量在逐年升高，导致葡萄酒乙醇含量也随之增加，在过去的20年中，酒度平均升高了2%（v/v）。较高的酒度给葡萄酒带来辛辣等各种不良感官影响。因此，在葡萄酒酿造过程中适当降低乙醇的合成，成为葡萄酒工业亟待解决的问题。利用物理化学方法诱变，或者利用基因工程策略改造葡萄酒发酵用酿酒酵母，而后对酿酒酵母突变库进行筛选，获得乙醇合成能力弱化的酿酒酵母菌株，将是一种降低葡萄酒酒度最为经济和简便的方法。为了从酿酒酵母突变库中筛选出低产乙醇的酵母菌株，需要对突变库中所有菌株进行发酵实验并检测其乙醇产量。

 

　　目前，常用的乙醇检测技术，包括：(1)仪器法，如气相色谱法仪和高效液相色谱仪法，这两种方法检测限高、速度快，但是使用费用普遍较高；(2)物理/化学法，如莫尔氏盐法、快速氧化法、密度瓶法，这类方法操作复杂，效率低；(3)酶法，利用醇脱氢酶(ADH)催化，使乙醇与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)反应，然后测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)荧光强度变化率，从而得出其酶促反应速率，对应乙醇的浓度制成标准曲线，样品中乙醇含量由标准曲线计算求得，该法乙醇含量检出限较高，为4.0×10-6mol/L，但酶法同样存在操作复杂效率低等问题。

　　

　　由此可见，由于缺少乙醇高通量检测方法，在从上述酵母突变库中筛选低产乙醇酵母菌株时，将面临筛选工作量巨大且效率低等问题。为此，需要开发一种新型的，能够快速从酿酒酵母突变库中，筛选出低产乙醇酵母菌株的方法。

 

　　在同等发酵体系下，根据物质守恒的原则，拥有较高生物量合成能力的酿酒酵母菌株，意味着有更多的碳源(糖)用于菌体的合成(图1)，而更少的碳源(糖)用于乙醇等其他代谢产物的合成。本研究以转录因子spt15随机突变酿酒酵母文库为研究对象，利用24孔板，以高生物量产率作为低产乙醇酿酒酵母的筛选标记，对spt15突变酵母文库进行初筛，对初筛获得的潜在目标菌株，再进一步通过模拟葡萄汁发酵并检测其乙醇合成能力，最终将获得乙醇合成能力较低且生物量较高的酿酒酵母菌株。本研究所采用的筛选策略将大幅度提高筛选效率和降低筛选成本。

 

　　1　材料与方法

 

　　1.1　材料与设备

 

　　1.1.1　菌种和质粒

 

 

 

　　Saccharomyces cerevisiae YS59，本研究室保藏；Escherichia coli JM109感受态细胞，大连宝生物公司；质粒pY16TEF1，江南大学刘立明教授惠赠。

 

　　1.1.2　主要试剂

 

　　总DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、酵母快速转化试剂盒，美国Omega生物技术公司；Diversify® PCR RandomMutagenesis Kit，Clontech；蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、酸水解酪蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司；YNB，北京索莱宝科技有限公司；-Ura do supplement，Clontech；葡萄糖、硫酸铵、泛酸（分析纯），四川西陇化工有限公司。

 

　　1.1.3　主要设备

 

　　MJX智能霉菌培养箱，宁波江南仪器厂；ELX800酶标仪，美国BioTek公司；MB100微孔板恒温振荡器，杭州奥盛仪器有限公司；SBA生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所。

 

　　1.1.4　培养基

 

　　(1)LB培养基；(2) YPD培养基；(3) SD-Ura培养基；(4)模拟葡萄汁

 

　　1.2　试验方法

 

　　spt15随机突变文库→spt15随机突变酿酒酵母文库→以生物量产率为指标初筛→高生物量产率菌株→以乙醇产率为指标复筛→低产乙醇菌株→spt15突变位点检测

 

　　1.2.1　spt15基因的PCR扩增

 

　　根据NCBI数据库中S. cerevisiae S 2 8 8 c s p t 1 5 基因序列( G e n eAcces s ion No. ：NC_001137)

和质粒pY16 TEF1序列， 利用primer premier 5.0软件设计引物spt15 P1/P2。引物委托上海生工合成。上游引物spt15 P1：5’-ATAGGGACCTAGACTTCAGG- 3’。下游引物spt15 P2：5’-GACCTCCCATTGATATTTAAG -3’。以50μL PCR 反应体系进行扩增，反应体系为：

 

 

 

　　1.2.2　spt15随机突变质粒文库的构建

 

　　按照Diversify® PCR RandomMutagenesis Kit（Clontech CodeNo.630703）使用说明，对spt15基因进行随机突变。其中，引物为：Primer F：5’- TAGAACTAGTGGATCCATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAG’- 3’；Primer R：5’- GCTTGATATCGAATTCTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACAG- 3’

 

 

 

　　1.2.3　酵母质粒的转化

 

　　按照Q u i c k & E a s y Ye a s tTransformation Mix (Cat. No.631851)试剂盒说明操作，将spt15随机突变质粒文库， 转化到S .cerevisiae YS59中，得到spt15随机突变酵母文库。

 

　　1.2.4　spt15随机突变酿酒酵母文库菌株的发酵试验

 

　　(1) 突变文库菌株的活化

 

　　将spt15随机突变酿酒酵母文库菌株分别接种于无菌24孔细胞培养板。24孔板的每孔加入1.5mLSDUra培养基，接种50μL菌液，置于微孔板摇床，400rpm，25℃活化24h。

 

　　(2) 高生物量产率酵母菌株的筛选

 

　　将活化好的突变菌株，按每孔50μL接种量，接种于每孔装有1.5mLSD-Ura培养基的无菌24孔细胞培养板。每个菌株均有四个重复，25℃条件下进行静置发酵。待发酵结束后检测每个菌株的OD560nm值。

 

　　(3) 低产乙醇目标菌株发酵能力的验证

 

　　根据1.2.4(2)的实验结果，挑选出OD560nm值较高的菌株，利用SD-Ura培养基活化后，按照2% 的接种量将其接种至装有250mL模拟葡萄汁的500mL三角瓶中，置于25℃条件下静置发酵，并在发酵过程中检测糖的消耗。待发酵结束后，检测OD560nm值、乙醇含量和挥发酸含量。

 

　　1.2.5　spt15基因突变碱基的检测

 

　　spt15基因的PCR扩增条件同

 

　　1.2.1，将PCR产物送上海生工公司

 

　　测序。将测序结果同S. cerevisiaeS 2 8 8 c s p t 1 5 基因序列( G e n eAccession No.：NC_001137)进行比对，找到突变碱基。

 

　　1.3　测定方法

 

　　酿酒酵母生物量（OD值）的测定，利用ELX800酶标仪对样品在560nm下进行OD值检测。葡萄糖的测定，按照SBA-40E型生物传感分析仪使用说明进行测定；总还原糖的测定，采用DNS法；挥发酸的测定，参照GB15038-2006T进行；乙醇的测定，SBA生物传感分析仪测定。

 

　　2　结果与分析

 

　　2.1　spt15随机突变酿酒酵母文库的构建

 

　　提取酿酒酵母Y S 5 9 的总DNA，利用PCR 扩增出spt15基因。将PCR扩增产物与pY16TEF1分别进行Eco RI和Bam HI双酶切，并连接。对连接产物进行测序，结果表明spt15基因连接正确，将其命名pY16TEF1-spt15。利用易错PCR试剂盒对pY16TEF1-spt15重组质粒中的spt15基因进行随机突变，得到spt15基因突变文库△spt15。将△spt15与pY16TEF1进行连接，获得质粒突变库pY16TEF1-△spt15。将重组质粒pY16TEF1-△spt15转化E. coli JM109，随机挑选20个转化子，提取质粒并进行spt15基因测序，结果显示spt15基因突变位点个数在2～10个不等，且突变位点和碱基无偏好性，从而说明spt15随机突变文库构建成功。

 

　　利用Q u i c k & E a s y Ye a s tTransformation Mix (Cat. No.631851)试剂盒，将spt15随机突变质粒文库，转化到S. cerevisiae YS59中。将转化液均匀涂布在SD-Ura固体培养基上，30℃培养96h左右，获得转化子(图2)。将所有转化子用液体SD-Ura培养基培养后保藏，从而获得S. cerevisiae YS59 spt15突变文库。

 

 

 

　　2.2　高生物量产率酿酒酵母菌株的筛选

 

　　利用S D - U r a 液体基进行S .cerevisiae YS59 spt15突变文库菌株的发酵，结果显示，与对照菌株S.cerevisiae YS59-pY16(含pY16TEF1)相比较，大部分菌株的生物量产率均有所增加，其中，编号为421、414、703、634、431、332、333、715、432、704、335、716、709和712，共14个菌株的生物量产率菌均大于70%，分别达到70%、70%、70%、71%、71%、72%、72%、73%、73%、73%、74%、81%、82%和85%（图3）。

 

 

 

　　2.3　高生物量酿酒酵母菌株的模拟葡萄汁发酵特征

 

　　为了验证上述所筛选出的14株菌株的产乙醇能力是否降低，将其分别进行葡萄模拟汁发酵试验(表1)。由表1可见：(1)乙醇产量均不同程度降低。乙醇产量低于9度的分别是634、703、712号菌株，分别比对照S. cerevisiae YS59-pY16降低了21.5%、27%和28.1%，其中的712号菌株的乙醇产率最低，达到0.327 g/g糖；(2)虽然各菌株均能顺利完成发酵，但是所用时间差异较大。704在26天完成发酵，而716需要49天才能完成发酵；(3)挥发酸均显著升高。所有测试菌株的挥发酸产量均超过3.0 g/L，远高于GB15037-2006中规定的不超过1.2g/L的要求。这说明，随着乙醇合成能力的减弱，来自于底物葡萄糖/果糖的碳，在减少流向乙醇合成途径的同时，增加了向挥发酸合成途径的流动，比如可能增强了乙酸合成途径(图4)。

 

　　2.4　低产乙醇菌株中spt15基因突变碱基的鉴定

 

 

 

　　提取712#酿酒酵母质粒(pY16-spt15-712)，以spt15 P1/P2为上下游引物，按照1.2.1的方法，对spt15基因进行PCR扩增(图5)，将扩增产物(spt15-712)进行切胶回收后，送上海生工公司进行测序。利用Vector NTI软件(10.3.0版)将测序结果与未突变的spt15基因序列(GeneAccession No.：NC_001137，spt15-ck)进行比对( 图6)，发现spt15-712上有9个碱基发生了突变，分别是A161G、T426C、T462C、T 4 9 3 A 、A 5 0 6 G 、T 5 4 6 C 、T622C、T658C、A750T。

 

 

　　3　结论

 

　　本文建立了一种高通量筛选低产乙醇酿酒酵母的方法。目前，虽然可以使用气相色谱法、密度瓶法、酶法等进行乙醇含量的检测，但是，这些方法在进行乙醇高通量检测时，均会存在效率不高等问题。为此，本文以S. cerevisiae YS59spt15突变文库菌株为研究对象，以高生物量产率作为低产乙醇酿酒酵母的筛选标记进行筛选。通过检测S. cerevisiae YS59 spt15突变文库菌株发酵结束后的OD560nm值，筛选出编号为332、333、335、414、421、431、432、634、703、704、 709、712、和715的高生物量产率菌株。将上述菌株分别利用葡萄模拟汁进行发酵，并检测其乙醇产量，结果显示，与对照菌株S .cerevisiae YS59-pY16相比较，以高生物量产率所筛选出来的菌株，其乙醇产量降低了7.1%~28.1%，其中，712号菌株乙醇产量降低最多，达到28.1%。对712号菌株的质粒pY16-spt15-712测序，发现spt15基因上共有9个碱基发生了突变，分别是A161G、T426C、T462C、T 4 9 3 A 、A 5 0 6 G 、T 5 4 6 C 、T622C、T658C、A750T。关于这9 个碱基突变导致712号酿酒酵母菌株乙醇产量降低的生理机制正在进行深入研究。