无核种质材料创制岗位

张剑侠 张朝红 刘国甜 徐炎 王跃进

　　大田杂交完成后，根据母本的花期或授粉日期在花后不同时间段，即胚败育前采集田间杂交幼果离体条件下进行无核葡萄胚挽救工作。不同葡萄品种的胚败育时间不同，采样时期也不同，尽量在幼胚发育数目最多且幼胚败育前的时候取材。根据不同的采样时间，将杂交幼果去回实验室进行胚珠离体发育培养。

　　胚珠离体发育培养阶段的具体步骤为：取杂交果实，接种前先用流水冲洗果粒1-2小时，置于广口瓶中，全程在超净工作台上进行。消毒方法选用二次消毒法，先用75%酒精浸泡消毒30秒后无菌水冲洗3次，再用5%次氯酸钠溶液（用前滴加几滴Tween 20）浸泡消毒15分钟，期间不断振荡，以保证瓶中的材料充分接触消毒剂，然后用无菌水漂洗3-5次。在超净工作台上用无菌的镊子和手术刀在培养皿中将无菌果粒剖开，从剖开果粒中选取长度大于2mm 的胚珠培养在胚珠发育培养基中。

　　杂交胚在败育前直接进行胚培养发育成幼苗是不可能的，必须先培养胚珠让胚在其内环境中继续增大发育，分化成有较强萌发力的幼胚。因此，在胚挽救过程中胚珠离体培养主要以模拟葡萄胚珠在其果肉内生长环境为前提，将其生长过程中的所需营养物质进行改进，其有害物质尽量减少。这些技术的实现主要通过培养基和培养条件来实施。目前用于胚珠离体发育的培养基有固体、液体和固-液双相三种形态培养基。固-液双相培养基即在固体培养基的上层覆盖一层液体培养基，固相和液相培养基除琼脂外其它成分完全相同，其优点是固体培养基的养分可以不断向液体培养基释放，同时培养基不易失水变干；同时模拟了胚珠在果肉中的环境适宜于胚发育。根据不同研究表明，固-液双向培养基优于单独使用的固体培养或者单独使用的液体培养基。

　　目前认为适宜葡萄胚珠培养的主要有 White培养基、ER培养基、Nitsch培养基、NN培养基或MM3培养基等，应用较多的为MM3培养基。在胚珠离体发育培养基中加入较高浓度的蔗糖（5-6%为宜），可以提高培养基的渗透压，抑制幼胚的早熟萌发，促进幼胚离体继续发育完善。高糖浓度培养基是为了保证活性物质被胚所吸收，有利于前期幼胚离体的正常发育。葡萄果实中含有较多的酚类物质，在胚挽救过程中，容易褐变，影响胚挽救的成苗率，在培养基中加入适量的抗褐化剂或吸附剂，可以减少褐化，常用的抗褐化剂或吸附剂为活性炭。因此，常用胚珠离体发育培养阶段培养基主要成分为：MM3＋蔗糖60g/L＋活性炭3g/L。

　　将杂交胚珠接种在100ml三角瓶中，每瓶接种15粒，模拟胚珠在果肉中的黑暗环境，在组培室盖上黑布进行黑暗离体培养，培养温度为25±2℃，相对湿度50-60%。60d后剥胚，接种到胚萌发培养基上，统计胚发育率。