病毒病防控岗位

胡国君 董雅凤 张尊平 范旭东 任芳

　　研究表明，热处理与茎尖培养相结合能够有效地脱除多种葡萄病毒，是目前培育葡萄无病毒原种母本树的主要途径。热处理与茎尖培养相结合之所以能够提高脱毒效率，主要由于热处理抑制了病毒繁殖扩散速度，使葡萄植株顶端的无毒区域扩大，从而有利于切取较大的茎尖，以提高培养成活率和脱毒率。病毒病防控岗位采用该项技术获得了30多个葡萄品种的无病毒原种母本树，并对一些脱毒品种进行了组培快繁。但在葡萄茎尖培养和组培快繁过程中真菌污染时有发生，造成部分脱毒样品死亡丢失，严重影响葡萄脱毒和脱毒材料离体保存研究工作的开展，为此，我们查阅相关文献，并采取一些行之有效的措施，较好地控制了真菌污染的发生。

　　组织培养材料的真菌污染主要来自两个方面，即外植体接种过程中的真菌污染和组培室培养过程中的真菌污染。防止外植体接种过程中发生真菌污染，应注意器皿洗涤、培养基制作、培养基灭菌、外植体灭菌、无菌台消毒和外植体接种等6个环节，每个环节操作不当均有可能造成真菌污染。

　　一般玻璃器皿用洗涤剂清洁完成后，要用清水冲洗几遍，确保干净后晾干，然后进行高压湿热或是高温干热灭菌。培养基的制作过程要严格按照操作流程，确保在无真菌污染源的环境中进行；培养基的灭菌主要在高压灭菌锅中进行湿热灭菌，一般植物培养基的灭菌时间为121℃ 15-20min，然后置于无真菌污染源的环境中备用；葡萄茎尖等外植体的灭菌应严格按照操作程序进行，升汞、次氯酸钠等消毒剂的浓度和处理时间要根据外植体的大小和部位来确定；外植体的接种需在无菌工作台中进行，接种前工作台需要开紫外灯灭菌30-60min，外植体处理完成后要将其接种到灭菌培养基中，然后放到无真菌污染源的培养室中培养。组培室的污染主要由一些外界因素造成，如组培室顶棚漏水、带菌空气对流进入以及进出人员携带菌源等，虽然此类真菌污染发生概率较低，但一旦发生，造成的损失更加严重，防治起来也更加困难。结合本实验室之前发生真菌污染的案例，可采取如下几项防控措施。

　　（1）坚决杜绝实验室的水槽里放置盆子、器皿等可以杜塞水槽的物品，防止脏水得不到及时疏通造成漏水污染；发现漏水后，及时清除培养瓶表面的污染物，并采用紫外灯、臭氧消毒器、消毒液等对空气、台面、地面进行高频次消毒处理；有可能造成污染的组培工具（主要是组培瓶）应及时清理，已经受到污染的瓶子，不可轻易打开盖子，需灭菌后放置一段时间，才能继续使用。

　　　　（2）对外来的试管苗或受到轻度污染还能补救的试管苗，操作时要特别小心，最好是换一个工作台和操作工具进行转接。

　　　　（3）组培室尽量采用空调等设备进行通风换气，如需要开窗换气，要选择太阳光线好，且空气质量较高的上午进行换气，而且要控制好时间。

　　（4）进出人员携带菌源造成的污染。组培室需由专人负责管理，进出需穿工作服。