天津综合试验站

李凯 黄建全 聂松青 张世兴 张鹤

　　香气质量是葡萄酒质量评价中的重要参考因素，它主要取决于来自葡萄、酿酒酵母、发酵前处理和陈酿储藏过程产生的香气化合物。葡萄酒中检测到的挥发性化合物多达800个，其中主要包括醇类、酯类、醛类和酮类，也包括其它类化合物，如萜类、萜烯类、硫醇类和甲氧基吡嗪类，然而，关键呈香化合物只是葡萄酒挥发性化合物中的小部分。基于挥发性化合物分析的许多种方法已经被应用于葡萄酒差异性和分类研究，其中包括气相色谱-质谱分析法（gas chromatographymassspectrometry,GC-MS）。同时基于顶空分析的萃取方法被应用于样品处理， 包括样品预先浓缩的固相微萃取（solid-phasemicroextraction,SPME）或者吹扫捕集，它们比静态顶空法的分辨力更好。采用主成分分析（principalcomponent analysis,PCA）分析数据可以直观地认识葡萄酒香气成分差异，而气味活度值（odor activityvalue,OAV）可以确定各香气成分对主体香气成分的贡献。

　　本实验以天津产区玫瑰香葡萄酒为研究对象，采用固相微萃取技术提取葡萄酒香气成分，用气相色谱-质谱分析法对葡萄酒香气成分进行检测，利用内标-标准曲线法量化分析并结合主成分分析及气味活度值分析葡萄酒香气成分，对比分析不同商业酿酒酵母对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，以便为客观评价葡萄酒香气质量及优化工艺提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　酿酒酵母与果胶酶

　　酿酒酿酒K1、R-HST、RC212和DV10均购自LALLEMAND公司，安琪葡萄酒果酒专用酵母，购自湖北安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母E491和果胶酶购自LAFFORT公司。

　　1.1.2　葡萄酒酿造

　　试验以酿酒鲜食兼用品种玫瑰香葡萄（vitis vinifera L.cv. MuscatHamburg）为原料，于2016年9月8日采自天津宁河区，可溶性固形物含量为17 Brix°，成熟度一致，无病害。参照李华等人的干红葡萄酒基本工艺，采用小容器发酵法进行酿造实验，发酵容器为40 L不锈钢罐。采用传统干红发酵工艺，葡萄原料经除梗破碎后转入发酵罐，添加 20 mg/L的果胶酶、60mg/L的二氧化硫，并于12 h 后按照 200 mg/L 的浓度添加商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），酒样1-6使用的商业酵母分别是K1、R-HST、RC212、DV10、安琪葡萄酒果酒专用酵母和E491（用 5%蔗糖水在37℃温度下活化 30 min后添加）。待发酵启动后，每隔4～6小时测定1次温度与比重，控制发酵温度在25-28℃，观察到酒帽形成后及时压帽。待比重降到0.992～0.996，并基本维持不变后进行皮渣分离。最后向酒样中加入50 mg/L的二氧化硫，满罐储藏至翌年1月份，所有酒样同时测定。

　　1.1.3　设备与试剂

　　无水乙醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；标样：β-蒎烯、柠檬烯、异松油烯、(+)-4-蒈烯、里那醇、玫瑰醚、α-松油醇、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、异丁酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、辛酸甲酯、丁二酸二乙酯、水杨酸甲酯、乙酸辛酯、辛酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、己酸异戊酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、乙酸香茅酯、反式-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸异戊酯、十四酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、苯甲醇、2-苯乙醇、正癸醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-壬酮、2-癸酮、辛酸、苯乙烯、2-辛醇，均购自Sigma-Aldrich公司；气相质谱联用仪：5977A-7890B GC-MS联用仪（Agilent，美国）；CTC自动进样装置（Agilent，美国）；萃取头：50/30μm DVB/CAR/PDMS型极性（Supelco，美国）；色谱柱：HP-5MS毛细管柱( 3 0m×0.25mm×0.25μm，Agilent)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　气相色谱-质谱仪( GC-MS)分析条件

　　色谱条件：载气(高纯氦气)：纯度≥99. 999%，流速1.0 mL/min，分流比为5:1；升温程序：35℃保持2 min，以4℃/min升至200℃，以30℃/min升至250℃，保持5 min；进样口温度：250℃。质谱检测条件： 离子源温度：230 ℃；传输线温度：250℃；电子轰击源：70 eV；扫描范围：30~300 amu。

　　1.2.2　定性定量分析

　　利用顶空固相微萃取-气质联用( HS-SPME-GC-MS)分析方法。定性分析： 对检测的挥发性成分通过未知物分析软件( 美国Agilent 公司)与NIST 11.L谱库( 美国 Agilent 公司) 提供的标准谱图进行匹配，如果匹配因子大于80（最高100），通过相同GC-MS条件下标准品的保留时间和质谱图进一步比对确认。

　　定量分析：称取2.4g NaCl于20mL顶空瓶中，然后加入葡萄酒样8mL，并加入内标物2-辛醇8 μL（450mg/L，无水乙醇稀释），顶空瓶加盖密封后待测。CTC固相微萃取条件：45℃预热5min，磁力搅拌子转速为250r/min（搅拌间歇式运行，转5s，停2s)，45℃萃取50min，然后GC进样，250℃解吸2min，采集数据。目标化合物峰面积积分采用选择离子模式( SIM)，采用内标-标准曲线法定量，标准曲线由5点绘制，由化学工作站计算定量结果。

　　1.2.3　感官分析

　　酒样在室温下(20℃ )用标准ISO玻璃杯 (ISO 3591:1977)进行感官评定。每个酒样3次重复。品尝小组由8个经过专业训练的品酒师组成（4男4女，25-32岁），酒样随机编号。香气分类强度采用4分制 (0为未闻到, 1 弱, 2 中度, 3 强, 4非常强)，可以用0.5分表示。采用7种香气分类来评估葡萄酒香气模型，分别是水果类、花卉类、植物类、香料类、烘焙类、化学类和其它。

　　2　结果与分析

　　2.1　葡萄酒中香气定量分析

　　通过顶空固相微萃取(HeadSpace Solid Phase Microextractions，HS-SPME) 和 GC-MS 联用技术对材料进行香气成分含量分析，葡萄酒香气成分含量见表1。共检测出54种香气成分，按照结构和特性将香气成分分为6类，分别是萜烯类、酯类、醇类、酮类、脂肪酸类和芳烃类，香气成分的总含量在118.3-146.9 mg/L之间。由图1可以看出，不同酒样的香气成分含量存在差异，其中Y1和Y6中香气成分总量较高；所有酒样的香气成分均以醇类和酯类为主，其中醇类含量最高，酯类次之，其余类型香气成分含量在总含量中占很小比例。

　　萜烯类香气成分在酒样中浓度在1252.41-1407.99ug/L之间，仅占总含量的0.88% -1.11%；9种萜烯类香气成分中里那醇的含量最高（429.61-506.65ug/L），香叶醇次之（318.46-448.20ug/L），β-蒎烯和香茅醇的含量也均超过100ug/L。酯类包括30种香气成分，数量占所有香气成分的55.56%，种类最为丰富，但含量仅占总含量的26.46%-29.30%，其中乙酸乙酯含量最高，在26048.13-32514.54ug/L之间，此外乳酸乙酯和辛酸乙酯的浓度也显著高于其它酯类。醇类虽然只有9种香气成分，但含量最多，占香气成分总含量的67.68%-71.17%，其中3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇的浓度较高，需要强调的是3-甲基-1-丁醇在所有检出香气成分中浓度最高。此外还检测出4种酮类成分、1种脂肪酸和1种芳烃，值得关注的是，Y1和Y3中检测到微量的苯乙烯（分别是23.42和10.61ug/L），其余酒样中均未检测到。

　　2.2　香气成分含量的主成分分析

　　主成分分析法利用降维思想，通过研究指标体系的内在结构关系，把多指标转化成少数几个相互独立并且包含原有指标大部分信息的综合指标，得到的综合指标（主成分）之间彼此独立，减少信息的交叉，使得分析评价结果具有客观性和准确性。根据香气定量分析结果，将所有玫瑰香葡萄酒的香气成分含量构成一个12×54的原始数据矩阵，然后运用SPSS v 17.0数据处理系统对54个成分指标进行处理，最终提取出5个主成分，它们的累计方差贡献率为100%（表2）。其中前三个主成分可以解释总方差的75.044%，以酒样在前三个主成分上的得分做图，结果如图2a所示，Y1和Y5位于第一、第二主成分的正半轴和第三主成分的负半轴围成的区域，Y2位于前三个主成分的负半轴围成的区域，Y3位于第一主成分的正半轴和第二、第三主成分的负半轴围成的区域，Y4位于第一、第三主成分的正半轴和第二主成分的负半轴围成的区域，Y6则位于第一主成分的负半轴和第二、第三主成分的正半轴围成的区域，6个酒样呈分散分布，说明不同商业酿酒酵母产生的香气成分之间差异明显，可以通过香气成分的主成分分析区分不同的商业酿酒酵母。以香气成分在前三个主成分上的载荷做图，结果如图2b所示，结合图2a分析各酒样与香气成分的相关性可知，V6、V8、V43和V54与Y1相关，因此最能反映Y1与其它酒样香气成分含量差异的是玫瑰醚(V6)、香茅醇(V8)、1-己醇(V43)和苯乙烯(V54)。同理，α-松油醇(V7)、异丁酸乙酯(V13)、乳酸乙酯(V16)和异丁醇(V40)最能反映Y2与其它酒样差异的香气成分；辛酸甲酯(V23)、辛酸乙酯(V27)、癸酸乙酯(V35)和辛酸(V53)最能反映Y4与其它酒样差异的香气成分；2-辛烯酸乙酯(V28)和正癸醇(V48）最能反映Y5与其它酒样的差异；柠檬烯(V02)、2-甲基丁酸乙酯(V17)、乙酸庚酯(V22)、丁二酸二乙酯(V24)、反式-4-癸烯酸乙酯(V34)、2-甲基-1-丁醇(V42)、1-庚醇(V44)和1-辛醇(V45)最能反映Y6与其它酒样的差异。上述与酒样相关的香气成分在对应酒样中的浓度明显高于其它酒样，由此可知，不同的商业酵母可以造成葡萄酒中某些香气成分的浓度差异。然而，香气成分实际浓度与香气真正的贡献率并不成正比，而与其气味活度值有着直接关系，气味活度值也体现出香气成分的挥发性大小及难易程度，因此将香气成分含量与阈值结合起来分析，更能客观地认识某种香气成分在葡萄酒香气中的贡献。

　　2.3　关键呈香成分分析

　　根据香气值理论，葡萄酒中香气成分含量高且阈值低的成分很可能是葡萄酒的特征香气或主体香气成分。在香气贡献中，由于香气成分之间的相似性，难免有些香气成分之间充斥着重叠和抑制作用，但对于估计单个香气成分实际气味贡献来说，采用气味活度值（OAV）来表征葡萄酒中各香气化合物对主体香气成分的贡献，是目前具有一定参考价值的客观方法，当OAV大于1时，这种香气成分对香气的贡献和影响较大。根据OAV值，共确定15种关键呈香香气成分（见表3），包括4种萜烯类、6种酯类、2种醇类、2种酮类和1种脂肪酸，分别是里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、异丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸；贡献甜香的异丁酸乙酯在Y3中OAV小于1，因此Y3的关键呈香香气成分为14种，其余酒样为15种。

　　15种关键呈香成分中辛酸乙酯的OAV值最高，主要贡献果香和脂肪气味，其它5种酯类的香气描述则是菠萝、苹果和香蕉等果香，因此酯类主要为玫瑰香葡萄酒提供果香。大马酮的OAV值仅次于辛酸乙酯，大马酮也属于C13-降异戊二烯衍生物，被认为是潜在影响葡萄和葡萄酒质量的芳香化合物，这类化合物主要来自类胡萝卜素的降解，具有强烈的果香和玫瑰香气，并且具有极低的香气阈值(0.05 ug/L)，它们在提高水果香气特征的同时掩蔽草本香气。里那醇、玫瑰醚、香茅醇和香叶醇都属于萜类化合物，萜类化合物主要来源于果实，在葡萄储藏或发酵过程中很少或不发生改变，是形成品种香气的重要化合物，玫瑰香葡萄独特的品种香气玫瑰味就来自于该类化合物，其中玫瑰醚和里那醇是对整体香气贡献最多的两种萜类化合物。3-甲基-1-丁醇在所有检出香气成分中浓度最高，然而由于其高嗅觉阈值（30mg/L），OAV值仅在1.97和2.58之间，乙酸乙酯和2-苯乙醇也同样如此，这也说明某种香气成分具有高浓度并不意味着对葡萄酒整体香气贡献大，而是与其嗅觉阈值密切相关。辛酸属于低级脂肪酸，具有明显奶酪，并夹带粗涩的味感，然而对整体酒质结构具有重要作用，并且可以抑制芳香酯的水解，因此对于香气平衡具有重要作用。Shinohara T研究表明，高含量(大于20 mg /L) 的 C6 -C10脂肪酸会表现不良风味，然而低含量时反而能够带来具有愉快气味，本研究中辛酸浓度范围是1.47-1.82 mg/L，可能会给整体香气带来愉悦气味。15种关键呈香成分的气味描述以令人愉悦的果香和花香为主，同时包括提升香气复杂度的蜂蜜、脂肪和奶酪等香气描述，它们构成了葡萄酒的整体香气，然而由于单个香气成分OAV不同以及香气成分之间的相互作用可能会影响葡萄酒的香气特征。

　　2.4　香气轮廓分析

　　应用感官分析来描述各香气类型的强度，不同商业酵母发酵后玫瑰香葡萄酒香气轮廓见图3。在感官分析过程中描述了7个香气类型，所有酒样中果香和花香的强度最高，但不同酒样的香气轮廓存在差异。酵母K1条件下（Y1）玫瑰香葡萄酒中的水果类香气中等，花卉类和植物类香气较弱，同时有略微的烘焙类和化学类香气，整体香气强度中等；酵母R-HST条件下（Y2）以较强的水果类和花卉类香气为主，略有植物类香气，整体香气强度强；酵母RC212条件下（Y3）有水果和花卉类香气强度中等，烘焙类和化学类香气较弱，略有植物类和香料类香气，整体香气强度中等；酵母DV10条件下（Y4）水果和花卉类香气强度中等，植物类和化学类香气较弱，略有香料类和烘焙类香气，整体香气强度中等；安琪葡萄酒果酒专用酵母条件下（Y5）水果类和花卉类香气很强，化学类香气弱，略有香料类香气，整体香气强度强；酵母E491条件下（Y6）水果类香气强度几乎达到极强状态，花卉类香气强，略有烘焙类和植物类香气，整体香气强度强。结合定量分析结果和OAV值我们可以发现，香气成分总浓度与葡萄酒香气强度并不成正比，此外，即使酒样的关键呈香香气成分一致，由于各香气成分OAV值不同，最终葡萄酒的香气特征和强度也不同，但是各个香气成分是如何相互作用并影响葡萄酒香气特征及强度的，还有待于进一步研究。

　　3　结论

　　本研究通过H S - S P M E 和GC-MS联用技术分析不同商业酿酒酵母对玫瑰香葡萄酒香气成分的影响，共检测出54种香气成分，其中商业酵母K1和RC212发酵的酒样中可以检测到微量的苯乙烯，其余53种香气成分是所有酒样的共有香气成分，包括9种萜烯类、30种酯类、9种醇类、4种酮类和1种脂肪酸类，不同酒样的总香气含量存在差异，但均以醇类和酯类为主。主成分分析结果显示，6种商业酵母发酵的玫瑰香葡萄酒在前三个主成分三维分布图中位置分散，不同商业酿酒酵母产生的香气成分之间差异明显；玫瑰醚、香茅醇、1-己醇和苯乙烯与酵母K1相关，α-松油醇、异丁酸乙酯、乳酸乙酯和异丁醇与酵母R-HST相关；辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和辛酸与酵母DV10相关；2-辛烯酸乙酯和正癸醇与安琪葡萄酒果酒专用酵母相关；柠檬烯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸庚酯、丁二酸二乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、1-庚醇和1-辛醇与酵母E491相关，上述香气成分在有相关性的酒样中浓度均显著高于其它酒样。关键呈香成分分析结果表明，RC212发酵的玫瑰香葡萄酒中关键呈香成分有14种，包括里那醇、玫瑰醚、香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、大马酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛酸；其余5种商业酿酒酵母发酵的玫瑰香葡萄酒中关键呈香成分除上述14种外，还包括异丁酸乙酯。关键香气成分是玫瑰香葡萄酒特征香气形成的重要因素，但由于各香气成分OAV值不同，导致最终葡萄酒的香气轮廓不同，其中值得关注的是，R-HST、安琪葡萄酒果酒专用酵母和E491发酵的玫瑰香葡萄酒香气典型性强，水果类和花卉类香气突出，可用于后续研究。