虫害防控岗位

王琦 程玉琴

　　葡萄灰皮诺病毒(Grapevine Pinotg r i s v i r u s，GPGV)为乙型线状病毒科（B e t a f l e x i v i r i d a e）纤毛病毒属（Trichovirus）成员。感染GPGV的葡萄叶片常表现褪绿斑驳、坏死和畸形症状，且这些症状在新生叶上更明显。该病毒对葡萄产量和品质危害严重。2014年我们对山东蓬莱试验站基地送检的金手指葡萄样品中用深度测序方法检测到了GPGV，这是该病毒在我国的首次发现。为了用更简单、快速、和经济的方法检测该病毒，我们建立了GPGV的RT-PCR检测方法。

　　1　实验材料、试剂与用具

　　（1）植物材料

　　葡萄叶柄。

　　（2）试剂

　　E A S Y s p i n 植物 RNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒（PrimeScript® RT reagent Kit,TaKaRa）、TaKaRa TaqTM DNA 聚合酶、dNTP Mixture （2.5mMe a c h ） 、双蒸水（ddH2O） 、50×TAE 电泳缓冲液（2M Tris-醋酸，100mM EDTA；配制100mL：Tris 24.2g，0.5M EDTA(pH 8.0)10mL，冰乙酸 5.7mL，去离子水定容到100 mL。电泳时将其稀释50倍）、液氮、GoldViewTM 核酸染料、DNA分子量大小（DL2000DNA Marker）及其附带的DNA电泳上样缓冲液（ 6 ×Load ingBuffer）。

　　（3）器具

　　PCR仪、微量台式冷冻离心机、电热恒温水槽、涡旋混合器、微量紫外/可见分光光度计、微波炉、天平、凝胶成像仪、灭菌锅、移液器、电泳仪、水平电泳槽、制胶架、凝胶板、加样梳、烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、1.5 mL离心管、0.2 mL离心管、Tip头、一次性手套和口罩、研钵。

　　（4）检测引物

　　正向引物CP-F：

　　PCR扩增产物是GPGV的CP基因部分序列，长度406 bp。

　　2　实验方法

　　（1）总RNA提取

　　取3-5个叶柄，用镊子剥下其外皮（韧皮部组织），混合后称取0.1 g~0.2 g放入研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末。将粉末转移到1.5 mL离心管，按照EASYspin植物 RNA 快速提取试剂盒的操作步骤提取总RNA。用微量紫外/可见分光光度计测定RNA浓度。

　　（2）反转录

　　将反转录试剂盒（PrimeScript®RT reagent Kit, TaKaRa）中组分及提取的RNA按表所示加入1.5 mL 离心管，混匀（表1）：

　　将离心管放在37℃ 恒温水槽中1 小时（h）后获得cDNA。

　　（3）PCR扩增

　　反转录后即进行 PCR 扩增，在 0.2 mL 离心管中加入下列组分（表2）：

　　混匀后将离心管放在PCR仪进行反应。PCR 反应条件：95℃ 预变性 5min；95℃ 变性 20s，52.0℃退火 30s，72℃ 延伸45s，35个循环；72℃ 延伸 5min。反应结束后取出。

　　（4） 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

　　①制备琼脂糖凝胶溶液（浓度为1.0%）：称取琼脂糖0.2g，加入1×TAE电泳缓冲液20mL，盖上封口膜，振荡后置微波炉中将琼脂糖充分融化，取出后加入适量GoldViewTM核酸染料（每100mL凝胶中加入2~5μL核酸染料）并轻摇混匀。

　　②凝胶的制备：将凝胶板置于制胶架中，插上加样梳，待胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入凝胶板上，除掉气泡。待凝胶冷却凝固后，垂直轻轻拔出梳子后将凝胶放入电泳槽内，加入1×TAE电泳缓冲液，使电泳缓冲液的液面略高出琼脂糖凝胶面。

　　③加样：在薄膜上混合PCR产物（5μL，约0.5~1g）和上样缓冲液（1μL）。用微量移液器分别将样品和DNA Marker加入琼脂糖凝胶的加样孔内，每加完一个样品，应更换一个Tip头，以防污染，加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶。注意：加样前要先记下加样的顺序。

　　④电泳：加样后，将电泳槽立即通电进行电泳，调节到合适电压（5V/cm）。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳。

　　⑤观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在凝胶成像仪下观察是否出现目的条带（约400bp）并拍照。如果有目的条带，说明样品中很可能感染了GPGV。