中国农业科学院植物保护研究所

王忠跃　孔繁芳　张昊

　　1　目的意义

　　葡萄霜霉病（Grape DownyMildew）是葡萄上的第一大世界性病害，多发生在温和潮湿的葡萄种植区域。该病害是气候主导的流行性病害，易爆发成灾，病害流行年份可造成20%-80%的损失，严重时几乎颗粒无收。现在防治霜霉病以化学防治为主，主要的化学药剂有甲氧基丙烯酸酯类：嘧菌酯、吡唑醚菌酯；羧酸酰胺类：烯酰吗啉、氟吗啉、双炔菌酰胺；苯基酰胺类：甲霜灵、苯霜灵、恶霜灵；咪唑啉：氰霜唑；氰基乙酰胺：霜脲氰。随着化学药剂的频繁、大量使用，葡萄霜霉病的抗药性问题逐渐严重，给生产上有效防控防控葡萄霜霉病带来严重的障碍。传统的抗药性检测方法单个叶盘稳定性不好、工作量大、试验条件要求严格、周期长效率低等缺点。因此，本团队针对葡萄霜霉病上常用的羧酸酰胺类（CAA）和甲氧基丙烯酸酯类（QoI）药剂，根据其抗药性基因位点开发了相应的TaqmanMGB探针。此方法能够准确区分野生型，抗药突变型与杂合型，灵敏度达1pg，并且除了单菌株鉴定之外，还可以进行混合样品定量检测，能够大大减轻工作量，可以简单、快速的进行霜霉病的抗药性检测，为合理轮换使用杀菌剂，降低农药使用量提供重要参考。

　　2　材料与方法

　　2.1 引物的设计

　　根据Mathias Blum已公布的羧酸酰胺类作用机理是抑制孢子囊形成，作用靶位点是纤维素合酶的1105位点处，M. Chatzidimopoulos已公布的苯基酰胺类杀菌剂作用机理是抑制核酸生物合成，根据纤维素合酶和细胞色素b基因序列的保守区，设计了2对用于TaqmanMGB检测技术所用引物（Cesa3F与Cesa3R、CytbF与CytbR），扩增大小分别为73、69bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　2.2 葡萄霜霉病菌DNA提取

　　利用OMEGA Fungal DNA Kit(D3390-02）试剂盒提取病原菌基因组DNA：

　　（1）将10～50 mg干燥病叶组织加入2 ml离心管内，加入石英砂和一颗玻璃珠，标注菌株名称，放入MiniBeadbeater-96研磨仪模块，液氮冷冻，定时100s，用组织研磨仪破碎样品；

　　（2）向已研磨的干燥组织中加入800μl Buffer FG1，强力涡旋确保样品全部混匀，所有组织块均被打碎；

　　（3）水浴锅65℃温浴10 min。温浴过程中反转离心管或震荡离心管所在的浮载物2～3次以帮助样品混合均匀；

　　（4）加入140μl Buffer FG2，并涡旋均匀。在相对离心力大于等于10000 rpm下离心10 min；

　　（5）小心吸取上清液（一般为700μl）至一个新的离心管内，确保不打破沉淀或吸取任何碎片。加入0.7倍体积（490μl）异丙醇，震荡均匀，使DNA沉淀；

　　（6）将离心管迅速置于离心机内，12000rmp下离心2min，来沉淀DNA（继续离心不会再提升DNA产量）；

　　（7）用移液器小心吸取或直接倒出上清液，同时保证白色沉淀未被倒掉。将离心管倒置于吸水纸上约1min，使残余水分流出。不必干燥DNA沉淀物；

　　（8）向管内加入300μl 65℃的ddH2O，强烈涡旋，确保沉淀被完全溶解（65℃下短暂静置有利于DNA溶解）；

　　（9）依次加入4μl RNaseA（20mg/ml），150μl Buffer FG3和300μl无水乙醇，将其全部涡旋均匀。若此时仍可见沉淀物，用移液枪反复抽吸10～15次，以确保能够获得均匀的混合物；

　　（10）用移液枪将全部样品（包括可能形成的沉淀物）移入一个装有蓝色吸附柱的2ml离心管内，相对离心力12000 rpm下离心1min，将其中的液体倒掉，弃离心管；

　　（1 1）将蓝色吸附柱重新转移到另一个离心管中，加入700μl DNA wash Buffer，离心机（12000rpm）离心1分钟后将离心管内液体倒掉（注意：DNA wash Buffer在使用前必须确保已加入了96%～100%的无水乙醇，进行稀释）；

　　（12）重复步骤11。向吸附柱内加700μl DNA wash Buffer，在相对离心力12000rpm下离心1min，倒掉管内液体，2ml离心管留到下一步使用；

　　（1 3）空管离心 2min ， 弃白色离心管，将蓝色吸附柱晾干10min，以使管内附着的液体完全挥发。

　　（14）将吸附柱转移到一个新的灭菌1.5ml离心管中，立即加入50-100μl预热至65℃的ElutionBuffer（或灭菌ddH2O），液体应保证加入到吸附柱的中央，在室温下静置3～5 min，在相对离心力12,000rpm下离心3～5 min来洗提DNA（注意：使用少量的Buffer体积将会显著提高DNA浓度，但会减少DNA产量）；

　　（15）重复步骤14，将白色管内的50μl Elution Buffer吸出后重新加入到蓝色吸附柱中央，室温下静置5min后，在相对离心力12000rpm下离心5分钟，进行二次洗脱，以使得DNA被完全洗脱下来；

　　（16）弃去蓝色吸附柱，将产物标号，于-20℃冰箱冻存，备用。

　　提取DNA后，利用核酸浓度测定仪（Gene公司，NanoVue Plus）测定浓度，Elution Buffer校正后测定，记录结果。

　　3　检测结果

　　采用此技术对部分葡萄产区进行了抗性鉴定，发现不同地区抗性差异明显（表2），辽宁北镇霜霉菌群体对QoI抗性达到100%，而山西群体QoI抗性频率为4%。对于CAA类杀菌剂，辽宁北镇霜霉菌群体抗性等位基因频率达到96%，说明抗性群体正在这一区域迅速蔓延，而山西群体CAA类抗性频率为1%。