鲜食品种选育岗位

　　无核葡萄作为重要的鲜食和制干品种，深受人们喜爱。传统的无核栽培品种存在不少问题：果粒小或抗病性差或品质不高，无法完全满足消费者或栽培者的需求，其遗传改良、品种更新成为无核葡萄发展的主要方向。但由于无核葡萄间杂交时合子胚未发育成熟就中途败育，无法得到杂交后代，给育种工作带来很大困难。用无籽与无籽品种杂交通过胚败育之前的胚挽救获得无核后代是一个重要的方法。无核母本‘Kismis’是引自匈牙利的残核中型种子败育型的无核品种，该品种平均单粒重5 g左右，最大单粒重7 g左右，丰产，果皮红色，果皮薄、脆，果肉质地硬，可溶性固形物含量17.7%，果实成熟期8月中下旬，是果穗较大、颜色好、果粒较大、品质很好的无核品种。但其缺点是果皮很涩，影响口感。

　　我们想通过该品种与其他无核品种杂交获得无涩味的后代，改善其口感。这几年我们对无核葡萄品种‘Kismis’进行了胚挽救工作，旨在为其建立一个完整的胚挽救技术体系，为获得该品种无涩味杂交后代提供技术支持。

　　1　材料和方法

　　1.1 试验材料

　　试验于2012-2015年在北京市农林科学院林业果树研究所实验室进行。供试材料为北京市农林科学院林业果树研究所葡萄资源圃内保存的7~8年生品种‘Kismis’与无核葡萄‘爱神玫瑰’杂交的果实。树体按优质高效葡萄栽培技术的要求进行正常田间管理：春季观察记录萌芽期，花期、浆果着色期、成熟期等。

　　1.2 试验方法

　　（1）果实及胚珠发育观察。

　　自授粉后20d起，每周从果穗上随机取杂交10个果，测量果实平均纵、横径、平均单粒重，以及每个果实内含胚珠的质量等。

　　（2）胚珠发育及培养基的筛选。‘Kismis’授粉后20d左右，采果穗带回，接种。接种步骤：先将果穗剪成4～5粒小穗放入烧杯中，用自来水冲洗1～2h，先用75%酒精漂洗1 次，用0.1%升汞消毒7~8min，用无菌水漂洗3次。用解剖刀取出胚珠接种在内装40mL培养基的100mL三角瓶中，每瓶接种4～6枚，于培养室内培养。胚珠发育培养基为N69；设置不同浓度IBA、GA3、6-BA。培养条件为温度(24±2）℃，光照强度1600lx，10h/d，蔗糖浓度30g/L，pH值5.8。

　　（3）胚萌发培养及培养基的筛选。材料在胚发育培养基内生长2个月后，将胚珠从中部横切后转入胚萌发培养基，注意将有胚的部分与培养基接触。选择基本培养基为1/2MS，GA3、IAA和IBA为生长调节剂，培养基内添加0.1%活性碳、20g/L蔗糖，pH值5.8。所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

　　2　结果与分析

　　2.1 无核葡萄‘Kismis’采样时期的确定

　　对于无核葡萄品种，胚发育到一定时期就会出现败育，通过对果实和胚珠测量来了解‘Kismis’无核葡萄果实发育及胚珠的发育进程。图 1 可知，无核葡萄‘Kismis’到8月上旬果实仍在增重，果实质量在授粉后20～48d处于缓慢增重期，授粉后55~62d果实增重相对较快，授粉62d之后重量增加变缓。 ‘Kismis’胚珠在授粉后27~34d增重最快，可看作快速发育期，随后逐渐减慢，到48d时胚珠质量达到最大，此后质量开始逐渐减小；48d以后再观察胚珠，发现胚乳变褐、呈半凝固，胚珠内腔变空，放在水中不下沉，说明胚珠已败育。对无核葡萄采样时，应该在胚发育程度最高但胚还未败育时进行，所以‘Kismis’在授粉后41~48d采样最好，此时果实质量达2g 左右；从胚发育来看从心形胚到鱼雷胚开始出现这个阶段采样最好。

　　2.2 无核葡萄‘Kismis’杂交胚发育培养基的筛选

　　胚珠培养60 d左右时，统计胚发育情况。统计时若发现所切的胚珠内为白色，表明胚珠还是活体，视为发育培养有效；若所切胚珠内腔空了或内腔已变褐，就视为发育培养无效，胚珠已死。表2可知，对于‘Kismis’杂交胚珠来说，组合2（1.0mg/L IBA+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3）胚珠发育率最高，为55.4%，显著高于其他组合；其次是组合6和组合8，胚珠发育率分别为36.0%、34.9%，这2个组合之间差异不显著。从培养基组成来看，0.5 mg/LGA3有利于胚的发育。由极差值可看出，3种激素因子对胚发育的影响为GA3＞6-BA＞IBA。

　　2.3 无核葡萄‘Kismis’杂交胚萌发培养基的筛选

　　将所有胚乳呈白色固体状的胚珠进行横切处理后接种到萌发培养基培养20~30 d，统计胚萌发情况。表3显示，对于‘Kismis’杂交胚珠来说，组合12（1.0mg/LIAA+0.5 mg/L GA3+0.2 mg/L IBA）胚萌发率最高，为26.24%，显著高于其他组合，其次是组合10和组合14，胚萌发率分别为19.6%、18.2%，这2个组合差异不显著。从培养基组成来看，0.5mg/L GA3有利于胚萌发。由极差值可以看出，2种激素因子对胚发育的影响为GA3＞IAA。

　　2.4 无核葡萄‘Kismis’杂交胚培苗的移栽

　　苗高8～10 cm生长健壮时将三角瓶带盖放入温室10 d后揭盖，经1周后移入消毒的蛭石中，保温、保湿1个月，再移至沙∶草炭∶土=1∶1∶2的花盆中。待气候适宜时再移入露地，能提高移栽成活率在70%以上。其中，苗在蛭石中每隔10 d浇1次含大量元素的营养液，同时在温室中搭塑料小拱棚，保证空气湿度80%。移栽苗一定要生长健壮，叶片深绿色。

　　3　讨论与结论

　　不同树种、品种胚抢救存在很大差异。最佳培养时期也即胚龄是影响胚抢救成功的关键因素之一，直接影响到胚培养成苗率的高低和胚培苗长势。不同果树对最佳培养时期的要求不同，应抓住胚发育最佳状态。因此，对于无核葡萄‘Kismis’来说。通过试验确定最佳培养期为授粉后（即盛花期）41~48d，此时果实质量达2g左右，从胚发育来看是从心形胚到鱼雷胚开始这个阶段。

　　在胚不同发育阶段激素浓度和形态都发生变化，并且不同葡萄品种对激素敏感程度有显著差异，且敏感程度随胚的发育程度不同而变化。刘海琳等认为在外源激素配比上，6-BA/IAA值高时，易诱导形成愈伤组织，当IAA/6-BA值增大时，易诱导成苗。我们经过几年研究发现，对于无核葡萄‘Kismis’，当IBA/6-BA较大时有助于胚发育和生长，且影响胚发育率的主要因素是GA3和6-BA。

　　有专家认为，在胚发育阶段较高浓度蔗糖（6%）及添加不同氨基酸，在后期胚萌发时较低蔗糖浓度有利于胚迅速萌发，且长成正常幼苗。我们的研究中与刘海琳相同，即使用3%（30g/L）蔗糖可满足‘Kismis’幼胚生长发育；在后期较低蔗糖浓度2%（20g/L）可解除高渗透压对胚萌发的抑制作用，有利于胚迅速萌发，且长成正常幼苗。通过本实验得出：适宜无核葡萄‘Kismis’杂交胚珠发育的培养基为：N69+1.0mg/L IBA +0.1mg/L6-BA+0.5mg/L GA3，胚萌发培养基为：1/2MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/LGA3+0.2mg/L IBA。