加工品种选育岗位

唐晓萍团队

　　摘 要：利用15对SSR引物对21种不同类型葡萄种质进行PCR扩增，对扩增情况、遗传距离与亲缘关系等进行分析。15对SSR引物共扩增出等位基因位点91个，其中多态性位点89个，多态性比率高达97.8%，其中13对引物扩增多态性百分率达到100%。21份供试材料间遗传相似系数变化范围在0.45-0.91之间，并在遗传相似系数0.62处被分为两大类群。研究表明SSR标记从分子水平上解析了不同类型葡萄种质的遗传差异性，揭示了材料间亲缘关系，为育种研究提供了一定参考依据。

　　引言

　　葡萄为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)的一种重要果树。中国是葡萄生产大国，栽培面积位居世界前列。葡萄品种数目繁多，全世界保存的葡萄资源大约有5000-15000多种，而我国种质资源圃中保存的就大约有2000多种。随着选育及审定品种迅速增加，葡萄在表型特征上的变异越来越丰富，传统的依据形态特征的种质鉴定方法在品种鉴别方面的难度越来越大。无论是在苗木生产还是品种及知识产权保护方面，葡萄种质资源鉴定的重要性越来越突出。因此，葡萄种质资源遗传多样性研究在种质资源管理、保护及葡萄育种方面意义重大。

　　SSR（ S i m p l e S e q u e n c eRepeat）分子标记即简单重复序列多态性，其为共显性标记，多态性高，利于做种质资源的遗传多样性分析。目前国内外已在苹果、李、马铃薯等多种园艺作物的品种鉴定、多样性分析、遗传作图以及基因定位等方面广泛应用。在葡萄种质资源研究方面，SSR分子标记技术也受到越来越多的研究者的重视。郭春苗等利用8对SSR引物对44个新疆地区栽植的葡萄品种进行了亲缘关系分析。尹玲等对近年来中国新育成的葡萄品种进行了SSR指纹图谱的构建，明确了品种间的亲缘关系。杜晶晶等依靠SSR分子标记对80份葡萄种质构建了分子身份证。Nami Goto-Yamamoto等利用SSR标记对葡萄野生类型及栽培类型间的遗传关系进行了深入探索。

　　冷翔鹏等利用SSR和RAPD 2种标记分别对22个遗传关系明确的巨峰系葡萄品种进行遗传分析,证明了两种标记用于葡萄种质资源遗传多样性分析的可靠性。李慧等利用SSR和IRAP标记对湖北‘关口葡萄’与欧亚种、欧美杂交种、美洲种间的亲缘关系进行了分析，对种质身份做了鉴定。樊秀彩等通过SSR标记对山葡萄与河岸葡萄种间的杂交后代进行了杂种鉴定。陶巧静等对葡萄诱变群体进行了SSR分子标记研究，验证了SSR标记用于葡萄诱变单株分子鉴定的可行性。

　　综上所述，SSR标记已在葡萄种质资源遗传多样性研究方面得到广泛应用，在葡萄种质鉴定、多样性分析等领域起到了重要作用。但是葡萄种质资源丰富多样，仍有很多材料遗传关系不清，例如多年来留存下来的前苏联种质材料等，这为种质鉴定评价及育种研究带来种种困扰。因此，本试验中选取在种属、用途及来源上具有较大差异的21份葡萄品种为材料，包括三种遗传关系不清的前苏联葡萄品种，对不同SSR位点进行PCR扩增研究，探究相关葡萄种质间的亲缘关系。本研究通过了解不同葡萄种质的遗传多样性和遗传基础，从分子水平上解析其遗传多样性差异和亲缘关系，为葡萄种质资源分类与品种鉴定提供理论依据，促进种质资源的有效开发和利用。

　　1　材料与方法

　　1.1　试验材料的选择

　　供试的21种葡萄品种的实验材料均来源于山西省农业科学院果树研究所，这些葡萄品种在种属、用途及来源上有所不同，详见表1。本研究于2014年5月底采集各葡萄品种的幼嫩叶片，液氮速冻并保存于-80℃超低温冰箱中备用。

　　1.2　DNA提取及SSR引物的选择

　　参照王军等的改良CTAB法进行基因组DNA的提取，提取材料选取葡萄的幼叶，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，利用Bio-Photometer核酸检测仪（德国Eppendorf公司）检测提取的DNA溶液浓度与纯度，根据检测结果将DNA溶液终浓度稀释至20ng/μl。

　　试验参照葡萄公共遗传图谱数据库中公布的52 对SSR引物进行筛选分析， 并最终确定15对引物应用于本研究，引物序列信息见表2，所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.3　DNA扩增和电泳

　　试验采用20μl PCR 扩增反应体系，其中含2μl 10×PCR buffer[100mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，500mmol/L KCl，0.1mg/ml 明胶]，2.0mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTPs，1U Taq DNA聚合酶，60ng模板DNA，0. 4 μmol/L引物（每条）。采用毛细管电泳法进行条带检测分析。

　　1.4　数据统计及分析

　　将扩增图片进行SSR标记的数据统计，数据编码采用0/1系统，即将有带记为1，无带记为0。根据0/1数据矩阵统计结果，利用NTSYSpc2.10软件计算不同样本间的遗传距离，并利用软件中QualitativeDate功能计算不同样本间的遗传相似系数，采用非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析。

　　2　结果与分析

　　2.1　不同SSR引物扩增结果

　　本试验利用15对SSR引物对21种葡萄种质资源进行SSR扩增，所得电泳谱带的具体分析结果如表3所示。15对引物共扩增出等位基因位点91个，其中多态性位点89个，多态性比率高达97.8%，扩增得到的DNA片段长度多在160~287bp之间。每对引物扩增出的等位位点数为2~11个，平均每对引物扩增出的等位位点数为6.1个。引物VMD5扩增所得的多态性位点最多，为11个，而引物SCU16VV、VVMD19所得的多态性位点最少，仅有1个。同时，引物SCU16VV与VVMD19扩增多态性百分率仅为50%，而其他引物均达到100%，可以将不同的种质材料进行有效区分与鉴定。这表明SSR标记可高效检测葡萄遗传多样性。

　　2.2　不同葡萄种质的遗传距离分析

　　本研究根据0/1数据矩阵统计结果，对不同样本间的遗传相似系数进行了计算，具体结果见表4。可以看出不同样本间的遗传相似系数变化范围在0.45-0.91之间，其中前苏联品种‘巴杨西列依’与‘毛葡萄’之间的遗传相似系数最小，为0.45；同为鲜食品种的‘红富士’与‘先锋’之间的遗传相似系数最高，为0.91，且二者均属欧美杂种。三个来源于前苏联的欧亚种品种‘保尔加尔’、‘十月’与‘巴杨西列依’之间的遗传相似系数并不高，在0.62-0.73之间。用作砧木的葡萄品种 ‘Ru140’和‘SO4’之间的遗传相似系数为0.85，相似性较高。常用做鲜食的葡萄品种间的遗传相似系数在0.60-0.91之间，普遍遗传相似性较高。常用于酿酒的‘梅露辄181’、‘赤霞珠’、‘柔丁香’、‘左山’和‘梅醇’品种间遗传相似系数为0.63-0.86。

　　2.3　不同葡萄种质的SSR聚类分析

　　本研究将21份葡萄种质材料15对SSR引物的0，1矩阵统计数据按照 UPGMA法进行了遗传聚类分析。结果显示：供试的21份材料在遗传相似系数0.62处产生了分离（图1）。在遗传相似系数0.62处可以将所有21份材料分成两大类，第一个大类包含有17个品种，占全部供试材料的80.95%，涵盖了酿酒葡萄品种与鲜食葡萄品种以及不同来源的品种类型，值得注意的是同为前苏联葡萄品种的‘保尔加尔’、‘十月’、‘巴杨西列依’虽在同一大类但亲缘关系相对较远，而‘保尔加尔’与日本品种‘巨峰’的亲缘关系较近。第二大类包括‘Ru140’、‘SO4’、‘华东白河’和‘毛葡萄’四份试材，其特点是均为野生类型，而在次级分支上‘Ru140’、‘SO4’被聚为一类，‘华东白河’和‘毛葡萄’被聚为一类，其中‘Ru140’、‘SO4’被用作葡萄砧木。

图1　基于SSR标记的21份葡萄种质聚类分析图

　　3　讨论

　　SSR标记是一种共显性分子标记，其检测所需DNA量少，且速度快，信息量大，可直接反映研究材料本质上的差异。因此，其在物种的起源、演化以及遗传变异等相关研究中应用较为广泛。遗传多样性可以反映试验材料在特定生存条件下基因的丰度，对育种研究工作具有重要指导意义。在葡萄遗传研究方面，已有较多利用SSR分子标记技术的研究报道。但应用SSR标记进行多种类型葡萄种质间的遗传多样性研究相对较少，同时由于葡萄种质的丰富性，仍有很多优良种质未得到评价与鉴定。本研究特选取在种属、用途及来源上具有较大差异的葡萄种质材料来进行遗传多样性分析，包括三种遗传关系不清的前苏联优良葡萄品种，探究相关葡萄种质间的亲缘关系。

　　方连玉等成功利用SSR标记对15份不同种属类型的葡萄种质进行鉴定。成冰等筛选出了14对SSR引物对13个酿酒葡萄品种进行了鉴定分析。本研究中种质材料间的遗传多样性分析结果显示，整体上可将21份种质材料分为两大类，第一类包括‘早黑宝’、‘赤霞珠’、‘梅鹿辄181’等17个品种，不同种属、不同用途及不同来源的类型未能明显的区分开，遗传多样性相对复杂，尤其是同为前苏联品种的‘保尔加尔’、‘十月’和‘巴杨西列依’均被分到了不同的亚类分支。而第二大类则相对较为简单清晰，所包括的4个品种均为野生类型，可见其遗传背景与第一大类的栽培品种类型具有较大差异。由于所选材料遗传背景较为复杂，同一种属类型的品种有些未能划分为同一亚类当中，这需要进一步深入挖掘研究。

　　4　结论

　　本研究利用15对SSR引物对21份不同类型的葡萄种质资源进行了遗传多样性研究，由亲缘关系远近将其分成两个类群。研究表明SSR标记从分子水平上解析了不同类型葡萄种质的遗传差异性，揭示了材料间亲缘关系，为育种研究提供了一定参考依据。