左家综合试验站

艾军 何伟 杨义明  范书田 王振兴

　　摘 要：探明低温胁迫对不同葡萄品种休眠期枝条抗寒性的影响。以‘北冰红’、‘左山一’、‘贝达’及‘双红’4种葡萄品种为试材，分别测定了系列低温处理下各品种的相对电导率、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量等变化，以电导法结合隶属函数法综合评价其抗寒性。随着处理温度的降低，4个品种相对电导率和MDA含量逐渐升高，呈‘S’型曲线变化，而游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量近似呈单峰曲线变化；通过相关分析发现指标平均隶属度与各生理生化指标相关性均较高。低温半致死温度几乎与综合评价结果一致，各品种抗寒性为：‘左山一’>‘双红’>‘贝达’>‘北冰红’。研究发现，指标平均隶属度变化曲线更能够全面、直观、准确地反映出葡萄品种枝条抗寒性差异的本质及判断其所能忍受的最低温度。

　　关键词：葡萄；枝条；抗寒指标；平均隶属度；综合评价

　　葡萄是落叶果树中耐寒性较弱的树种之一, 一般在平均极端最低温度低于-15℃以北的地区就有可能发生不同程度的冻害。而目前我国葡萄基地集中分布于北方地区，其冬季的严寒气候严重影响着葡萄大规模生产。所以冻害是限制葡萄生产的重要因素之一，并且在树体发生冻害后，需要一年或多年才能恢复，严重的甚至需要重新建园种植，从而使生产者损失严重。因此鉴定葡萄的抗寒性，对于葡萄抗寒育种、评价及葡萄品种的推广栽培具有重要现实意义，同时可为葡萄抗寒栽培措施的制定提供理论依据。

　　目前抗寒性快速鉴定的方法主要是电导法，将其配以Logistic方程求得的低温半致死温度（LT50）能很好地区别除不同植物或组织间的抗寒性差异，现已被广泛运用于核桃、李属砧木及葡萄等多种木本植物中。而植物抗寒性是一个复杂的生理生化过程，所以单一的指标很难反映其抗寒本质。鲁金星等[8]214t42825431`.34dxf-在x34x40研究酿酒葡萄抗寒性时认为，要全面地评价葡萄抗寒性，应当由其各抗寒生理指标进行综合评判。曹建东等评价了葡萄不同砧木品种的抗寒性，用相对电导率以及可溶性蛋白、 游离脯氨酸及丙二醛（MDA）含量等来概括了8个指标中的绝大多数抗寒信息。付晓伟研究了葡萄不同品种根系的抗寒性，将抗寒指标简化为半致死温度、MDA、根系生物结构特征。尽管如此，对于葡萄抗寒性鉴定与评价工作，尚无统一的方法和体系。因此，我们试图将电导法与隶属函数法相结合，以指标平均隶属度对4个葡萄品种抗寒性进行综合评价，以期为葡萄抗寒性的科学鉴定、评价及抗寒育种研究工作提供理论依据。

　　1　材料与方法

1.1　材料

试验于2013年12月至2014年3月在中国农业科学院特产研究所进行，试材取自国家果树种质左家山葡萄圃，取栽培管理基本相同各葡萄品种（‘北冰红’、‘左山一’、‘贝达’、‘双红’）一年生、成熟度一致的休眠期枝条。剪成长约20cm的枝段，依次用自来水、蒸馏水和去离子水冲洗干净，晾干后，用石蜡将枝条两端封住，装入密封的自封袋后，保存于-16℃冰箱中。

　　1.2　方法

　　（1）材料冷冻处理 使用高低温交变试验箱（北京雅士林试验设备有限公司GDJW-225型）对枝条进行低温处理，处理温度分别为-20℃，-24℃，-28℃，-32℃，-36℃，-40℃，-44℃。以4.0℃/h的速度升降温，到设定温度后保持12h，温度回升至室温后，取出静置5小时后再进行电导率测定。以-16℃保存的枝段为对照，每个

处理重复3次，每次重复随机抽取8个枝段。

　　（2）相对电导率测定及低温半致死温度的测定 取不同品种低温处理后枝条，去除表皮，避开芽眼，剪成2mm-3mm的薄片，混合均匀，称取1g放入50ml刻度离心管中，每个处理重复3次。加20ml去离子水，抽气40min后，摇匀，用DDS-308A型电导仪（雷磁）测定其初电导值R1，再将试管置于水浴锅中，沸水浴1h（封口），之后室温下静置5h，再测其终电导值R2，最后用下列公式计算相对电导率：相对电导率=(R1/R2)×100%，相对电导率拟合Logistic回归方程为：y=K/（1+ae-bx）。其中y为相对电导率，x为处理温度，K为相对电导率饱和值，a、b为方程参数。若拟合度（r）显著时，再计算低温半致死温度（LT50），具体参照莫惠栋的方法。

　　（3）生化指标的测定 各指标测定取低温处理后枝条，去除表皮，避开芽眼，剪碎，混匀后，每次称取0.2g。MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法；游离脯氨酸量的测定采用茚三酮比色法；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白使用考马斯亮蓝G-250染色法。每个品种重复 3次。

　　（4）抗寒性综合评判 采用隶属函数法，①与抗寒性呈正相关的参数脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量计算公式:U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）；②与抗寒性呈负相关的参数电导率、丙二醛（MDA ）计算公式:U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

　　①、②中 U（Xijk）表示各指标的隶属度值；Xijk 表示表第i个品种第j个温度处理阶段第k个指标的隶属度，且U（Xijk）∈[0,1]；Xijk表示第i个品种第j个温度处理阶段第k个指标的测定值；Xmax、Xmin为所有品种第 k 项指标的最大值和最小值。 各梯度低温下，以4个品种的5项指标隶属度的平均值作为抗寒力综合评判标准，进行比较。

　　所有数据用Microsoft Excel2003整理计算，用SAS 9.1软件对数据进行差异显著性分析及各理化指标的相关性分析。

　　2　结果与分析

　　2.1 低温对葡萄枝条相对电导率的影响及其低温半致死温度

　　由表1可知，在试验低温处理范围内，葡萄枝条的相对电导率随处理温度的降低而不断升高。经-16℃~-44℃低温处理下，‘北冰红’、‘左山一’、‘贝达’和‘双红’4个品种相对电导率分别增加了0.98、0.93、1.34和0.97倍。经低温处理后，不同葡萄品种枝条相对电导率增加的速率有所不同。‘北冰红’枝条相对电导率从-16℃到-24℃间平缓上升，之后急剧升高，到-32℃达到峰值，之后变化区趋于平稳；‘贝达’枝条相对电导率在-16℃~ -28℃温度内逐渐增加，之后随温度降低开始较快增加，在-40时到达最大值；‘左山一’和‘双红’枝条相对电导率变化总体呈上升趋势：二者在-16℃~ -32℃温度范围内，相对电导率增加速率较慢，而在-32℃~-44℃温度范围内，其增加速率较快。在试验低温范围内，随温度降低，4个葡萄品种枝条相对电导率呈‘S’型变化（图1）。

　　植物受到低温胁迫时，细胞膜透性加重，最终导致相对电导率的增加，所以相对电导率可以直接反应植物抗寒性。以相对电导率结合Logistic 方程求得植物半致死温度(LT50) ，更能准确地比较不同植物的抗寒性。由试材的相对电导率求得的logistic方程、相关系数及低温半致死温度，结果如表2所示：相对电导率经logistic方程拟合后，4个品种的相关系数在0.9220~0.9899之间，均达显著水平。由logistic方程计算得出‘北冰红’、‘左山一’、‘贝达’和‘双红’枝条的半致死温度分别为-24.52℃、-37.15℃、-29.77℃和-35.79℃，即初步判定其抗寒性强弱排序为：‘左山一’>‘双红’>‘贝达’>‘北冰红’。

　　2.2　低温对葡萄枝条MDA含量的影响

　　MDA含量的增加是植物受到逆境胁迫后细胞膜透性增加的一个重要标志，其含量高低可以反映植物膜系统的受伤程度。由表3可知，4个葡萄品种枝条MDA含量呈‘S’型变化，但各自骤升时期有明显差异。‘北冰红’最早出现，在-20℃~-36℃间MDA急剧增加，之后增加趋于平缓；‘贝达’次之，其MDA在-24℃~-36℃间剧增，之后也缓慢增加；‘左山一’与‘双红’枝条中MDA含量变化相似，在-16℃~-36℃间，其含量增加平稳，而在-36℃之后，其含量才突然骤升。同时在试验各梯度低温处理下，‘左山1’与‘双红’较‘北冰红’与‘贝达’都含有含量相对较低的MDA，且差异显著（P<0.05），这可能与其抗寒力差异有关，在一定温度范围内，抗寒力强的品种，低温逆境下MDA保持较低水平。

　　2.3　低温对葡萄枝条游离脯氨酸含量影响

　　渗透胁迫下，游离脯氨酸容易积累，是重要的渗透调节物质，能稳定细胞蛋白质结构、保护细胞内大生物分子和保持氮含量。由表4可知，随着温度的降低，4个品种枝条的游离脯氨酸含量都表现出“逐渐升高—峰值—缓慢降低”的趋势。在-24℃时，‘北冰红’的游离脯氨酸含量达到峰值，为29.91μg•g-1，增加了26.68%，之后缓慢降低；‘左山一’的游离脯氨酸含量峰值出现在-36℃时，为40.57μg•g-1；提高了95.52%；在-28℃时，‘贝达’的游离脯氨酸含量达到最大值，为34.12μg•g-1，升高了50.84%，之后缓慢降低；‘双红’的游离脯氨酸含量在-32℃时升至最高，为36.35μg•g-1，增幅为51.02%。在-40℃和-44℃时，4个品种枝条游离脯氨酸含量都呈降低趋势，但品种间差异显著（P<0.05），游离脯氨酸含量由高到低依次为‘左山一’、‘双红’、‘贝达’和‘北冰红’。

　　2.4　低温对葡萄枝条可溶性糖含量影响

　　植物在低温胁迫下，细胞中可溶性糖能降低原生质的冰点，提高原生质活性，增强细胞液流动性，提高抗寒能力。如表5所示，随着低温胁迫程度的加大，4个品种枝条可溶性糖含量变化呈先增高后下降的趋势。‘北冰红’的可溶性糖含量在-16℃~-28℃范围内呈上升趋势，并在-28℃时出现峰值18.90%，此后随温度降低呈下降趋势；‘贝达’的可溶性糖含量在-32℃时达到最大值14.71%，此后随温度降低也呈下降趋势；‘左山一’和‘双红’的可溶性糖含量在-36℃时升至最大值，分别为19.52%和24.26%，此后也有所下降。总体看来，‘贝达’枝条可溶性糖含量显著低于其余3个品种；在-40℃和-44℃时，4个品种枝条可溶性糖含量都呈降低趋势，但品种间差异显著（P<0.05），其含量由高到低依次为‘双红’、‘左山一’、‘北冰红’和‘贝达’。

　　2.5　低温对葡萄枝条可溶性蛋白含量影响

　　植物在低温逆境条件下，可溶性蛋白质含量的增加，有助于提高细胞内的束缚水含量，降低冰点，利于防止细胞内结冰，避免细胞冰冻死亡，从而增强了植物耐低温能力。如表6所示，随着处理温度降低，4个品种枝条可溶性蛋白含量变化呈先增高后下降的趋势，不同品种不同低温阶段增幅有所不同。与-16℃相比，低温处理后，‘北冰红’、‘左山一’、‘贝达’和‘双红’枝条可溶性蛋白最大增幅分别为22.86%、59.69%、35.24%和54.97%，而其出现的低温阶段也不一致，分别是-24℃、-36℃、-28℃和-36℃。-40℃和-44℃时，‘左山一’和‘双红’枝条可溶性蛋白含量显著高于‘贝达’和‘北冰红’。

　　2.6　各抗寒指标的相关性分析及抗寒性综合评判

　　用SAS9.1对5个生理指标及其隶属度的平均值进行相关性分析，得出各数据间相关系数矩阵（表7）。5项指标隶属度的平均值与相对电导率、MDA、游离脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白的相关性均达极显著水平（P<0.001），相关系数分别为-0.607、-0.593、0.726、0.589和0.544。各指标间也存在一定相关性，其中相对电导率与丙二醛、游离脯氨酸与可溶性糖、游离脯氨酸与可溶性蛋白、可溶性糖与可溶性蛋白之间存在显著正相关，其余指标相互间显著不相关。

　　由于各指标之间存在一定的相关性， 使得它们所反映的抗寒信息存在重叠现象。因此葡萄抗寒鉴定中，不能盲目单独依赖1个或2个指标对葡萄枝条的抗寒性进行评价。为了较全面地直观反映葡萄枝条在各试验低温下的抗寒性，运用隶属函数法，以5项指标隶属度的平均值对4个葡萄品种枝条抗寒性进行综合评判。其平均隶属度越大，表明抗寒性越强，反之抗寒性越弱；且各品种5项指标隶属度的平均值峰值点左右所对应的低温，即为其最大耐低温能力。结果如图2所示，‘北冰红’平均隶属度缓慢升高到0.54（-24℃）后，随温度的降低而不断降低；‘贝达’枝条平均隶属度也先缓慢升高，在-28℃左右时出现峰值0.58，之后也不断下降；而‘左山一’与‘双红’枝条平均隶属度最大值较高，分别为0.77和0.75，出现也较晚，都出现在-36℃左右；在-40℃和-44℃下，‘左山一’与‘双红’也保持着比‘北冰红’与‘贝达’明显较高的平均隶属度。结合4个品种的低温半致死温度分析可知，平均隶属度综合评判与电导法测定的抗寒性基本一致、结果可靠，4个品种抗寒性强弱的排序为：‘左山一’>‘双红’>‘贝达’>‘北冰红’。

　　3　讨论

　　植物低温半致死温度作为评价植物抗寒性强弱的指标，是指在植物最适生长温度以下，植物达到半致死状态时的低温，若当温度继续降低时，植物将会受到不可逆伤害，甚至死亡。采用电导法，以相对电导率结合Logistic曲线方程可推导半致死温度，这更能准确地反映植物所耐受的低温极限。该试验采用Logistic方程对系列低温处理后葡萄枝条相对电导率与温度关系曲线进行拟合，所有品种的拟合度r值均达显著水平，所求低温半致死温度可靠。4个葡萄品种枝条的LT50中，‘左山一’最低，‘双红’次之，‘北冰红’最高，这符合田间越冬能力表现：在资源圃中的葡萄‘贝达’和‘北冰红’在入冬时就必须做好埋土防寒工作，否则不能安全越冬，而‘左山一’和‘双红’不需要埋土防寒也能安全越冬。因此葡萄品种抗寒性仍然是北方寒冷地区葡萄规模栽培的限制因子。

　　MDA 是衡量膜系统受害的重要指标之一，它源于的膜脂受害后的过氧化作用，对细胞具有很强的毒性。 在低温处理过程中，抗寒性弱的材料MDA含量显著上升，从而加剧细胞膜脂过氧化程度；反之，抗寒性强的材料则有一定的调节能力，使MDA含量维持在相对较低水平，使细胞结构及功能得到保护，降低了低温对细胞的伤害。本试验中，4个葡萄品种枝条经低温处后，MDA含量均随温度降低而不断升高，抗寒力较强品种（‘左山一’和‘双红’）MDA含量保持了相对较低水平，而抗寒力较弱品种（‘北冰红’和‘贝达’）有着较高水平的MDA含量。此外，MAD含量变化与相对电导率变化呈显著正相关关系，相关系数达0.941，因此低温处理后，测定枝条MDA含量可作为葡萄抗寒性鉴定一个比较可靠的理化指标。

　　植物体内重要的渗透调节物质主要是游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，在低温逆境条件下，它们的大量积累有助于减轻低温对植物的伤害。本研究表明。低温处理后，枝条游离脯氨酸与抗寒指标的平均隶属度相关性较大，而可溶性糖和可溶性蛋白与抗寒指标的平均隶属度虽较小，但相关系数也达0.5（中度相关）以上，说明游离脯氨酸含量可作为葡萄品种枝条抗寒性的初步判定指标，而可溶性糖及可溶性蛋白适宜作为综合评价时的抗寒指标。

　　植物抗寒性是一个复杂的生理生化变化过程，即所有抗寒指标的综合表现，受多种因素影响，孤立的用单一指标很难反映其抗寒本质。为克服单个抗寒指标的不足，隶属函数法、主成分分析法及灰色关联结合聚类分析法等已广泛用于植物抗寒性的综合评价工作。该研究通过比较电导法试验结果与指标平均隶属度变化曲线发现，二者结论一致、可靠。

　　4　结论

　　4个葡萄品种枝条经低温处理后，相对电导率、丙二醛含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白指标与指标平均隶属度间存在较强的相关性，因此可以用指标平均隶属度来分析比较葡萄品种枝条的抗寒性。指标平均隶属度变化曲线能够更好地反映出葡萄品种枝条的抗寒性差异的本质及判断其所能忍受的最低温度，4个葡萄品种枝条抗寒性由弱到强依次为：‘左山一’>‘双红’>‘贝达’>‘北冰红’。