左家综合试验站

王春伟 刘迎雪 艾军 杨义明 赵滢

　　摘要：2014年9月，从吉林省集安市山葡萄种植基地发现疑似镰刀菌侵染的病害样本，经分离获得4个真菌分离物。经过致病性测定完成柯赫氏法则，证实分离物为导致山葡萄果实腐烂的病原菌。采用形态学特征和分子鉴定方法对病原菌进行鉴定，经鉴定,病原菌为燕麦镰刀菌 (Fusarium avenaceum)。燕麦镰刀菌可导致山葡萄果实腐烂系国内外首次报道。

　　关键词：山葡萄果腐病； 燕麦镰刀菌； 形态学特征； 分子鉴定

　　1　材料与方法

　　1.1　供试材料

　　病害样品采自吉林省集安市山葡萄种植基地，品种为‘北冰红’。

　　供试培养基为PDA培养基。

　　1.2　病原菌的分离纯化

　　采用组织分离法和单孢分离法进行病原菌分离，剪取植物发病组织，先于75%酒精表面消毒0.5min，然后0.1%L汞消毒1min，最后用无菌水反复洗3次，晾干后将其接种于PDA培养基上于25℃培养，3d后对其进行纯化培养。

　　1.3　致病性测定

　　采用离体接种法进行致病性测定。用消毒针头制造伤口后，用100μl孢子悬液（1×106/ml）喷于山葡萄果实。选取健康果实用于接种，以无菌水作为对照，并保持在25℃，相对湿度90％。每个实验重复3次，接种3d后开始观察发病情况。根据Koch法则，对发病的组织进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。

　　1.4　病原菌的鉴定

　　（1） 形态学特征鉴定： 以Booth (1988)的分类系统为基础，再参照J. F. Leslie的《The FusariumLaboratory Manual》，王拱辰的《常见镰刀菌鉴定指南》和陈鸿逵的《浙江镰刀菌志》进行鉴定，主要包括菌落的培养性状、孢子形态等。

　　（2）分子鉴定：采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌DNA，对DNA的内转录间隔区(ITS)基因序列、转录延伸因子（TEF-1α）序列、微管蛋白（β-tubulin）基因序列进行PCR扩增，扩增产物由深圳华大基因公司纯化并测序。将测序完成后得到的序列在GenBank中的核酸数据库中的相关序列进行比对，对引起山葡萄果实腐烂病的镰刀菌鉴定到种，确定其分类地位。

　　2　结果与分析

　　2.1　病害症状描述及发病率调查

　　症状表现为柔软，圆形，稍凹陷，水浸状的病斑，且在果实表面形成大量的白色至粉红色菌丝（见图1）。经调查，该病害约可造成5%左右的发病率。

　　2.2　致病性测定

　　接种后7~10天，所有菌株均造成接种植物果实腐烂，出现柔软的，水浸状病斑，产生大量白色至红色菌丝，与发现症状时相同的症状。病原体可以成功地在PDA培养基上重新分离和培养，与燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)形态特征一致。

　　2.3　形态学鉴定

　　菌落生长速度： P D A 培养基2 5 ℃ 条件下培养5 d 菌落直径40～45mm。菌丝的颜色先为白色，然后变为浅黄色，再变为玫瑰红色，有丰富的气生菌丝。气生菌丝从卷毛状茂盛，初期白色至浅黄色后至淡红色毡状，菌落中心玫瑰红色，边缘白色，后期菌落中心为黄棕色，菌落背面产生紫红色色素。大型分生孢子两侧平滑，薄壁，3至5个分隔，大小18.28-37.5×3.83-5.63μm（重复50次），小分生孢子为纺锤型，12个分隔，7.52-9.44×2.51-4.39μm（重复50次），未发现厚垣孢子（见图2）。

　　2.4　分子鉴定

　　通过DNA提取后进行PCR扩增rDNA的内转录间隔区（ITS，555 bp），翻译延伸因子（EF-1α，646 bp）基因序列，以及β-微管蛋白（TUB2，1222 bp）基因序列，登录GenBank，分别获得登录号KP170730，KP170732和KP170733。

　　将各个基因序列ITS 序列，TEF-1α序列，TUB2序列分别与NCBI 数据库进行同源性比对，结果表明该菌株的ITS序列与菌株Fave3（KJ562378）具有99％的相似性，菌株TEF-1α序列与MAFF239206（AB674239）具有99％的相似性，TUB2序列菌株FRC-09495（GQ915436）具有99％的相似性。

　　3　结论与讨论

　　利用致病性测定试验、形态学鉴定和分子鉴定方法相结合，确认引起山葡萄果实腐烂的病原菌为燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)。燕麦镰刀菌作为山葡萄果实腐烂病病原菌系国内外首次报道，这一新病害虽然危害不大，在生产中造成约5%的发病率，但具有潜在的发病风险，如环境条件适宜发病且未及时发现时，可能会对山葡萄产量和质量产生严重影响。这一发现对山葡萄果实腐烂病的发生规律及综合防治等具有重要参考价值。