中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心

董雅凤 张尊平 范旭东

 

　　由于缺乏有效的检测手段和健全的无病毒苗木繁育体系，我国葡萄病毒病进呈扩展蔓延趋势。为有效控制葡萄病毒病的危害，推进葡萄无病毒栽培发展，我国颁布实施了农业行业标准《葡萄苗木脱毒技术规范》（NY/T 2378-2013）。该标准规定了葡萄苗木脱毒的术语和定义，脱毒对象和脱毒方法。

 

　　1　术语和定义

 

　　（1）葡萄苗木（gr apevinenursery stock）：采用接穗和砧木嫁接繁育的葡萄嫁接苗，以及通过扦插、组织培养等方法繁育的葡萄自根苗。

 

　　（2） 脱毒（ v i r u selimination）：采取一定的技术措施，从感染病毒的植株得到无病毒后代植株（不含有葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒1、葡萄卷叶病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑点病毒）的过程。

 

　　（3）茎尖培养 （shoot t ipculture）：将嫩梢的生长点连同叶原基，大小约0.2 cm~0.3 cm的茎尖接种于试管内无菌培养基上，促其长成完整植株的过程。

 

　　（4）葡萄试管苗（grapevineplantlet in vitro）：指通过离体培养方法获得的无菌葡萄瓶苗。

 

　　（5） 热处理（ h e a ttreatment）：将盆栽苗或试管苗置于恒温培养箱中，于38℃恒温或38℃与32℃变温，每天光照12~16h条件下生长，通过高温抑制病毒扩散，以获得无病毒茎尖的过程。

 

　　2　脱毒对象

 

　　（2）  葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）

 

　　（2） 葡萄卷叶相关病毒1（Grapevine leafroll-associated virus1,GLRaV-1）

 

　　（3） 葡萄卷叶相关病毒3（Grapevine leafroll-associated virus3，GLRaV-3）

 

　　（4）葡萄病毒A（Grapevinevirus A，GVA）

 

　　（5） 葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFkV）

 

　　（6）其他病毒脱除参照本标准。

 

　　3　脱毒方法

 

　　（1）器材：超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、体视显微镜、pH计、电磁炉、电冰箱、电子天平、消毒器、弯头镊子（25cm）、解剖刀、解剖针、组织培养瓶、封口膜、培养皿、三角瓶等。

 

　　（2）盆栽苗热处理：取待脱毒葡萄品种的盆栽苗置于温室中，苗木萌动发芽后，放入光照培养箱中。恒温热处理：在38±1℃条件下处理30~40d。变温热处理：32℃和38℃每隔8h变换一次，处理60d。每天光照12h以上，光照强度为5000~10000 lux。处理结束后从该盆栽苗上剪取顶芽，进行茎尖培养，茎尖培养方法见3-（4）。

 

　　（3） 试管苗热处理： 待脱毒试管苗转接后，于25~ 28℃继代培养10~15d，置恒温培养箱中（ 3 2 ℃ ） 培养1 周， 然后升温至38±1℃，每天光照12h以上，光照强度1500～2000lux，依据不同葡萄品种特性恒温热处理30~40d或变温热处理（温度为32℃和38℃每隔8h变换一次）60d。为防止培养基干燥，热处理期间，可加入少量灭菌的1/2 MS培养基。热处理到期后，从试管苗上剥取0.2~ 0.3cm茎尖进行培养。

 

　　（4）茎尖培养

 

　　培养基制备：采用MS基本培养基，添加植物生长调节剂、蔗糖、琼脂等，配制培养基的具体操作程序见附录A。

 

　　盆栽苗热处理后茎尖分离培养：从热处理到期的盆栽苗上，采集生长旺盛、长约1～2cm的顶梢，去掉叶片，在超净工作台上进行消毒处理。先用75％酒精浸泡0.5min，经蒸馏水冲洗后放入0.1%升汞中消毒5～10min，无菌水浸洗3～5次，取出后置于无菌培养皿上，在解剖镜下剥取0.2～0.3cm大小的茎尖，接种在分化增殖培养基上。

 

　　试管苗热处理后茎尖分离培养： 从热处理到期的试管苗上取顶梢， 在无菌培养皿上剥取0.2～0.3cm大小的茎尖，接种在分化增殖培养基上。

 

　　茎尖增殖： 将接种的培养瓶置于2 5 ℃ ～ 2 8 ℃ 、光照强度1000～2000lux、每天光照时间12h的组培室中培养。根据生长状况，每1~2个月转接1次，转接时，先将试管苗基部愈伤组织切除，再切成带1个腋芽的茎段，接种在增殖培养基上。由同一个茎尖增殖得到的组培苗为一个芽系，统一编号。继代5~6次，同一芽系的试管苗数量达到5瓶以上时，进行病毒检测。

 

　　病毒检测：茎尖培养获得的所有芽系均需进行病毒检测，以初步明确脱毒结果。

 

　　生根移栽：春季，经检测不带病毒的芽系，切取带1个芽的茎段，接种到生根培养基上，在组培室培养1个月后，将培养瓶置于智能温室或日光温室中，闭瓶炼苗1～2周。移栽前，在瓶中加少量水使培养基软化。移栽时，从瓶中取出幼苗，将试管苗根部附着的培养基洗干净，栽入装有基质（蛭石∶草炭=1:1）的塑料营养钵中。试管苗移栽后，加盖塑料薄膜和遮阳网保湿、遮荫，保持空气相对湿度80%以上，温度控制在20～28℃。移栽试管苗病毒检测：翌年春季和秋季，从移栽成活的试管苗上采集嫩叶和休眠枝条进行病毒检测。

 

　　脱毒结果判定：根据试管苗和移栽成活苗的病毒检测结果判定脱毒结果，如未检测到本标准规定的脱毒对象，没有表现任何病毒病症状，且生长和结果性状符合该品种特性，则可以作为无病毒原种保存，为无病毒母本树和苗木繁育提供繁殖材料，具体要求参见《葡萄无病毒母本树和苗木》NY/T 1843。