南宁综合试验站

林玲 白先进 张瑛 周咏梅 韦荣福

　　摘要：为对葡萄栽培过程中选用抗性品种提供依据及为分析不同葡萄品种对霜霉病的抗性机理奠定基础。选用不同抗性的葡萄品种，毛葡萄野生株系（抗病品种）和欧美杂种醉人香及H-norris(感病品种)为实验材料，分析在葡萄霜霉病病原菌诱导下，其叶片内的超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），过氧化物酶（POD）酶活性的变化。在几个供试的葡萄品种中，超氧化物歧化酶（SOD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性与品种抗病性的相关性不大；葡萄叶片过氧化物酶（POD）活性与葡萄对霜霉病抗性之间存在一定相关性。在葡萄霜霉病病原菌诱导后，抗病品种的POD活性升高幅度大，且比感病品种持续时间长，可作为鉴别葡萄品种霜霉病抗性鉴定的辅助评价指标。

　　关键词：防御酶，霜霉病，抗病性，生理指标

　　引言

　　葡萄霜霉病[ P l a sma p a r a viticola(Berk.et Curtis)Berl.et de Toni]遍及世界各葡萄产区，是葡萄生产上重要的真菌病害之一。该病主要危害叶片，严重时叶片焦枯早落；另外也可危害新梢和果粒，新梢感病后，被害处产生水渍状病斑，表面有黄白色霉状物，病斑纵向扩展，颜色逐渐变褐，稍凹陷，严重时新梢停止生长，扭曲枯死；果粒感病，幼嫩果粒极易染病，病幼果变灰色，果粒和果柄表面密生白色霉层。降雨量大，相对湿度高是引起该病流行的关键气候因子。在长江流域七八月份为其发病盛期，但在春夏多雨的地区或年份，像广西等湿热地区，从葡萄萌芽至果实采收整个生育期均是防治葡萄霜霉病的关键时期，这使得葡萄栽培过程农药用量增加，果实品质下降。葡萄栽培的实践证明，利用抗病品种防治病害是最经济有效而且绿色环保的措施，因此，抗病育种就显得更加重要。但是，抗病新品种的选育必须是在有抗病种质资源的前提下进行。笔者通过田间调查发现不同的葡萄品种对霜霉病的抗性存在着明显的差异，几个原产于广西的野生毛葡萄株系对霜霉病表现为极强的抗性（林玲等，2013）。因此，我们进一步对毛葡萄接种霜霉病病原菌后其叶片内几种酶活性的变化进行分析，为抗性种质资源的利用及相应的病害防治提供依据。植物受到病原物侵染时，体内一系列防御酶会发生某些变化。利用某些防御酶类的活性变化作为植物抗病性鉴定的生化指标已有研究报道。超氧化物歧化酶（SOD）是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶（马旭俊，2002），SOD对机体的氧化和抗氧平衡起着重要作用，能清除氧阴离子自由基（O2-）,保护细胞免受损伤。周晓惠等（2007）在对甜瓜蔓枯病的研究发现，甜瓜植株受蔓枯病菌侵染后，抗病材料的SOD活性高于感病材料，抗病材料的过氧化氢酶（CAT）活性高于感病材料。沈文飚等（1997）利用大豆花叶病毒浸染大豆叶片时发现，在浸染早期，抗病品种过氧化物酶的活性急剧增加且出现新的同工酶谱带。过氧化氢酶（CAT）在植物-病原物互作中的作用也有不少报道。曾永山等（2003）研究发现，不同梯度抗性品种与锈病互作的早期，过氧化氢酶（CAT）的比活性变化率与品种抗病性有密切关系，在免疫和抗病品种中降低，在感病品种中则上升；李淑菊等（2003）在对黄瓜的研究发现，黄瓜感染黑星病菌后，抗病品种的POD活性峰出现要早于感病品种，且酶活性提高幅度大。李惠华等（2007）对番木瓜的研究发现，番木瓜植株感染环斑花叶病毒后，抗病品种的过氧化物酶（POD）活性变化最为明显，感病品种POD活性变化缓慢。针对我们栽培过程中调查发现的几个毛葡萄野生株系对霜霉病表现为抗性强的特点，进一步分析其接种霜霉病病原菌前后其叶片中SOD、CAT和POD的活性变化。探索葡萄霜霉病的致病机理和不同葡萄品种的抗性反应，为在葡萄的栽培过程中选用抗病品种和病害防治提供基础资料。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料

　　实验材料为5个毛葡萄野生株系，1个毛葡萄与欧亚种杂交后代，欧美杂种醉人香与H-Norris。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　病害调查与接种

　　采用室内离体接种法诱发霜霉病，从田间采集感染霜霉病的叶片，清水冲去旧孢子囊，保温（22℃）、保湿（相对湿度85%）培养24小时，待新孢子长出后用毛刷刷下孢子，用无菌水配置孢子悬液（浓度为：12×10倍显微镜下每个视野含20×25个孢子）。接种前用载玻片萌芽法测定孢子囊生命活力，以萌芽率在75%以上为有效。采用喷雾接种，接种后保湿24h，接种前采样与接种后每天采样进行酶活性测定，连续测定6天。

　　1.2.2 　酶活性测定

　　（1） 酶液的制备： 采集1.00g葡萄叶片，洗净，放入研钵中，加入8ml 0.05M pH7.8 磷酸缓冲液，冰浴研磨，于10000rmp(0~4℃)离心10~15min，取上清液为粗酶提取液。

　　（2） SOD活性测定 ：酶反应体系加样次序：1.5ml 0.05mol/L 磷酸缓冲液；0.3ml 130mmol/L Met溶液；0.3ml 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT)溶液；0.3ml 100μmol/L EDTA－Na2液；0.3ml 20μmol/L 核黄素；0.1ml酶液；0.5ml蒸馏水，总体积3.3ml。另取4～6支试管做对照，对照管以缓冲液代替酶液。混匀后将2支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min。（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不光照的对照管做空白，分别测定其他各管的OD560。

　　（3） POD活性测定：反应液3ml(100ml 0.1M Ph6.0磷缓中加入0.5ml愈创木酚、1ml 30% H2O2，充分摇匀)于试管，加入酶提取液0.05ml，迅速摇匀后倒入比色皿。以不加酶液的反应液做为空白。于OD470下读数，每隔15秒读一次数，共3分钟。

（4） CAT活性测定：反应液3ml（2ml0.1M pH7.8磷缓，1ml 0.08% H2O2），加入0.2ml酶液。以0.1M pH7.8磷缓做空白。迅速摇匀后倒入比色皿，于OD240（用石英比色皿）下测定吸光值。每隔15秒读一次数，共3分钟。

　　2　结果与分析

　　2.1　田间霜霉病抗性鉴定

　　从表1可以看出，所调查的几个毛葡萄野生株系中，香山二号和香山七号表现为免疫，香山五号，西坡一号，春莓一号表现为高抗；毛葡萄杂交后代741表现为抗病，两个欧美杂交种表现为感病，但是醉人香的的平均病情指数要高于H-Norris.

　　2.2　接种前后叶片中SOD 活性的变化

　　从图1可以看出，几个毛葡萄野生株系及欧美杂种叶片中SOD活性在接种霜霉病病原菌前后的变化与表1的抗病性之间的相关性不大，在接种霜霉病病原菌后第1，2天SOD活性均有小幅的升高，第3，4天便开始下降，除香山2号在第5天又有一个小幅的上升，其余供试株系均一直保持下降趋势。

　　2.3　接种前后叶片中POD活性的变化

　　从图2可以看出，所有供试株系中，在接种霜霉病病原菌后第1天POD活性均有小幅上升，但是从第2天起，醉人香和H-norris的POD活性便开始下降，到第5天一直保持下降的趋势；几个毛葡萄野生株系及杂交后代741的POD活性到接种霜霉病病原菌后第2天继续上升到一个高峰，到接种后第3天POD活性才开始下降。

　　2.4　接种前后叶片中CAT活性的变化

　　从图3可以看出，所有供试株系在接种霜霉病病原菌后，其叶片内CAT活性从接种后第1天到第5天均呈现下降的趋势，直到第5天，所有供试株系的CAT活性降到一个较接近的范围。

　　3　讨论

　　3.1　SOD活性与葡萄抗霜霉病的关系

　　超氧化物歧化酶（ SOD）普遍存在于动植物体内，具有清除自由基、保护蛋白质、细胞膜免受活性氧的伤害。李兰真等（1999）用条锈菌接种小麦后，感病品种SOD活性要高于抗病品种，但随着生育期的推移，酶活性下降速度要比抗病品种快。齐慧霞等（2006）对不同品种酿酒葡萄感染霜霉病后，发现抗病品种能在短时间内使SOD活性恢复至正常的状态，其自我调节恢复正常的能力明显大于感病品种。本实验中，供试的几个品种SOD活性变化不大，且均能很快恢复至正常水平，这与前人的研究稍有差异。

　　3.2　POD活性与葡萄抗霜霉病的关系

　　过氧化物酶（POD）可与酚类物质相互作用而产生醌类物质，而醌类物质将参与保护植物免受进一步的伤害，杨国顺等（1997）研究表明，葡萄叶片中POD活性与葡萄抗黑痘病呈正相关。史娟等（2002）研究亦表明，葡萄品种间的抗病性与POD活性存在一定相关性。房玉林等（2007）研究表明，葡萄叶片中PPO活性与POD活性与葡萄霜霉病抗性之间具有一定相关性。吕晓梅等（2003）对野生番茄抗叶霉病生理指标的研究发现，在接种叶霉菌生理小种后，野生番茄叶片中POD活性增加且与抗病性呈正相关。本实验中，对霜霉病抗性强的毛葡萄野生株系，在接种霜霉病病原菌后，其叶片内的POD活性升高幅度明显要高于感病的欧美杂种醉人香和H-norris，结果表明，葡萄叶片POD活性与葡萄抗霜霉病之间存在一定相关性，可作为鉴别品种抗性的生理指标，这与前人的研究结论一致。

　　3.3　CAT活性与葡萄抗霜霉病的关系

　　过氧化氢酶（CAT）是广泛存在于动植物体内的一种末端氧化酶，催化生物体内过氧化氢分解，防止过氧化。曾永三（2003）对豇豆抗锈病的研究发现，感染锈病后，过氧化氢酶( CAT) 的比活性变化率与品种抗性有较密切的关系, 在免疫和抗病品种中降低, 在感病品种中则上升。张彬（2006）在对小麦与锈病的互作关系中发现，抗病品种的CAT活性在接种后0-24h迅速降低，此后略有回升；感病品种在整个过程中CAT活性变化不明显。本实验中，所有供试品种在接种霜霉病病原菌后，其叶片内CAT活性均呈下降趋势，这与前人的研究不一致，具体原因所在，还需进一步探讨。

　　4　结论

　　经过对不同葡萄品种接种霜霉病病原菌后，分析其叶片内各种防御酶活性的变化，结果表明，在几个供试的葡萄品种中，超氧化物歧化酶（SOD）活性与过氧化氢酶（CAT）活性与品种抗病性的相关性不大，葡萄叶片过氧化物酶（POD）活性与葡萄抗霜霉病之间存在一定相关性，可作为鉴别葡萄品种霜霉病抗性鉴定的辅助评价指标。