加工研究室酿酒微生物岗位

 

 

　　氨基甲酸乙酯——一个几十年前就被国际食品安全人士关注的话题，在黄酒行业亦有数年被关注，食品工作者在努力的把这一安全隐患控制在安全范围之内；对于葡萄酒，这个名词似乎因2014年8月在武威召开的"国家级酿酒师评委年会上“被严正提及，并上升到了技术规范法规层面，涉及到限量标准和违规责任措施，”一次超标即吊销生产资格，不予整改“，足见后果相当严重。为此也引起了业内酿酒工作者的广泛关注和警惕。简单资料告诉我们氨基甲酸乙酯的形成与“N元素”有着千丝万缕的联系，酿酒师们便很直接的联想到“酵母营养剂”上，正值发酵季节前夕，很多酿酒师都会在酵母营养剂的应用上有诸多的担忧和不解，这里想和大家一起较为详细的梳理探讨这一问题。

 

　　1　何为氨基甲酸乙酯

 

　　氨 基 甲 酸 乙 酯 ( E t h y l Carbamate，EC) 又名尿烷，是发酵食物和酒精饮品在发酵或贮存过程中天然产生的污染物，包括葡萄酒在内的发酵饮料和食品中含有的微量氨基甲酸乙酯早在1943年就被证实是一种致癌物质。

 

　　2　国际葡萄酒行业限量

 

　　加拿大和美国的卫生与预防部门规定佐餐葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量不得超过30μg/L和15μg/L。目前我国尚未对葡萄酒中的EC作出限量标准，但预计将在2015年元月颁布执行。

 

　　3　氨基甲酸乙酯在葡萄酒中的形

 

　　成机制在葡萄酒中“尿素”和“瓜氨酸”被普遍认为是氨基甲酸乙酯的重要前体物质，这二者却与葡萄酒中关键应用微生物“酵母”和“乳酸菌”对精氨酸的代谢息息相关。

 

　　（1）尿素和瓜氨酸的EC形成机理：

 

　　尿素在酸性条件下与乙醇加热反应形成ECN H 2C O N H 2+ C 2H 5O H ＝C2H5OCONH2+NH3（几乎为葡萄酒中EC主要来源）

 

　　瓜氨酸在加热条件下与乙醇反应形成EC

 

　　这一机理对葡萄酒中EC含量的影响程度目前存在很大争议，有待进一步研究；

 

　　（2）葡萄酒中尿素和瓜氨酸的形成机理

 

　　酵母的尿素循环代谢：即分子氨经多步骤代谢形成，精氨酸在精氨酸酶的作用下降解为尿素和鸟氨酸，而鸟氨酸又进一步参与循环代谢形成瓜氨酸，正常代谢速率情况下，代谢中产生的尿素和瓜氨酸将作为细胞代谢氮源再次参与循环代谢过程，但这一过程受很多因素调控，如酵母自身的氮代谢和介质中精氨酸含量调控，当葡萄汁中精氨酸含量过高或者菌株（包括部分野生杂菌）对尿素和瓜氨酸等氮源能力不足时代谢中就会出现尿素和瓜氨酸的外泄，这也为EC的产生增加了隐患；厌氧条件下尿素的积累会越多风险越大；

 

　　精氨酸在乳酸菌（MLB)胞内精氨酸脱亚氨基酶作用下降解产生瓜氨酸、鸟氨酸及氨甲酰磷酸。瓜氨酸是氨基甲酸乙酯形成的重要前体物质， 在乳酸菌胞内精氨酸降解过程中，一部分瓜氨酸被分泌到胞外，从而扩散到培养基中，另一部分在胞内继续参加生化反应，Liu[2002]等发现乳酸菌胞内精氨酸降解主要在pH3.5～4，因此葡萄酒中，该代谢过程可能是EC的主要来源之一；同时Liu等（2002）对多株明串珠菌研究发现，MLF过程中EC生成量主要取决菌种，不同菌种差异很大，自然触发的MLF和高EC生产量的菌种都容易造成精氨酸代谢过程中的瓜氨酸外渗，应该尽量避免；

 

　　（3）氰酸在铜离子催化作用乙醇反应生成 EC

 

　　H 2N C O N H 2（ 热 分 解 ）→NH3+HOCN（+C2H5OH 条件）→H2NCO2C2H5

 

　　这一点做水果蒸馏酒如白兰地的朋友尤其要注意了，有研究表明，在蒸馏的过程中，高温会使一部分尿素受热分解生成氰酸，随后生成的氰酸会和酒精反应生成氨基甲酸乙酯。

 

　　也有研究显示，发酵过程中存在于植物中的氰化物（或氰）也会产于氨基甲酸乙酯的生成反应。据国际统计，蒸馏酒中EC在世界上各种酒类中居于高水平，值得警惕。

 

　　（4）酵母氮源对EC的影响

 

　　这里主要需要了解酵母的氮代谢途径：酿酒酵母可同化氮源（YAN）包括铵盐和含α-氨基氮的氨基酸（脯氨酸除外，它在有氧发酵时不能作为酵母的氮源）。 它对氮的吸收分两步：首先通过特定的氨基酸透性酶吸收有效的氮源；其次降解氮源参与氮代谢途；研究发现：当培养基中同时存在多种氮源时，酿酒酵母会优先利用丰富型氮源如谷氨酰胺、铵盐、谷氨酸、天冬酰胺等. 只有在培养基中缺少上述丰富型氮源，才会开始利用精氨酸、尿素、尿囊素、GABA和脯氨酸等贫乏型氮源；大致先后顺序为天冬氨酸/ 谷氨酰胺>铵盐>谷氨酸>尿素>GABA>脯氨酸；

 

　　V i r g i n a 等 （ 2 0 0 3 ） 和Inglis(2002)研究表明，磷酸氢二铵（DAP）的添加量和时间也会影响EC的生成量，因此DAP作为能否酵母营养剂也有待于进一步研究，大家亦应慎用。

 

　　至于其它营养剂类，目前也有研究证实，有机质营养剂类在消耗速率上远远低于无机铵盐类，从据此理论讲，选择合适的有机质营养剂能有效降低尿素和瓜氨酸在胞内快速聚集，从而降低溢出胞外的风险；

 

　　（5）带酒脚陈酿对EC的影响

 

　　研究表面，这个工艺对EC的影响取决于发酵原酒中的结余可同化氮含量和通风状态，如果可同化氮含量非常少甚至没有，这种风险则很小，同样严格的厌氧条件也会增加EC上升的风险；

 

　　4　降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的措施

 

　　任何解决问题的方向都是从产生途径着手，进行尽可能拦截式干预。

 

　　（1）加强对葡萄基地的管理，减少氮肥的使用，尤其瓜果后叶面氮肥的使用；

 

　　（2）低尿素分泌菌种的选育；

 

　　（3）钝化精氨酸代谢乳酸菌的选育；

 

　　（4）酿造工艺的优化控制：尽可能避免高温、绝对厌氧发酵环境，避免酒脚陈酿；

 

　　（5）新工艺的应用。