旱区品种选育岗位

李玉玲　王勇　骆强伟

植物叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，叶绿素含量的测定无论是在生理上还是在选育品种以及抗性研究等方面都是必要的。研磨法是传统的叶绿素提取方法，先把植物材料经过研磨，然后过滤，定容后用分光光度计进行比色测定，整个过程繁琐且误差较大，操作中还易受光氧化的破坏，不适于对大量叶绿素的提取。浸提法采用溶剂不同提取液对葡萄组培苗叶绿素提取效果的影响浸泡叶片的方法将叶绿素萃取出来，然后进行比色测定。直接浸提植物叶片并测定叶绿素提取量，免除了传统提取中研磨、离心过滤等繁琐手续，方法简单易行、效率高。且减少了误差来源，稳定性好。本试验以葡萄组培苗叶片为试材，研究2种叶绿素提取方法对葡萄组培苗叶绿素提取量的影响，以期为葡萄组培苗叶绿素的提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所实验室保存的葡萄组培苗，选取生长发育正常的葡萄组培苗叶片。

1.2 仪器

分光光度计为unico2000型，乙醇，丙酮均为分析纯。

1.3 方法

（1）试验设计 按体积比配制浸提液，共设８个处理：处理１，95%乙醇；处理2，80%丙酮；处理3，乙醇:丙酮＝1:1；处理4，乙醇∶丙酮＝1:2。

（2）叶绿素含量测定 将选取的叶片剪碎去叶脉，混匀。准确称取新鲜样品0.10g（共３份）分别置于研钵中，加不同的提取液25ml研磨，将研磨后的样品滤入25ml棕色容量瓶中，定容至25ml，把提取液倒入直径1cm比色杯内，以提取液为空白对照，在波长663nm和665nm下测定吸光度，每个样品３次重复。根据Lamber -Beer定律，叶绿素a（Ca）和叶绿素b（Cb）的含量与不同波长下光密度值之间的关系如下。

叶绿素a(mg/g)Ca=(12.71A663nm-2.59A645nm)×V/1000×W叶绿素b (mg / g )Cb= ( 2 2 .88A645nm-4. 6 7A663nm)×V/1000×W叶绿素总量(mg/g) C(a+b)=(20.29A645nm +8. 04A663nm)V/1000×W式中，A663，A645分别为相应波长下的光密度值，V为提取液的体积，W为叶片质量。

（3）提取时间对葡萄组培苗叶绿素提取效果的影响 为了测定叶绿素含量的最佳提取时间，共计设置(8h，12h，16h， 20h，24h，28h)6个不同提取时间的处理，分别在波长为645nm和663nm下测定光密度值。结果用DPS 统计软件进行方差分析，显著水平0.05。

2 结果与分析

2.1 研磨法中提取溶剂对葡萄组培苗叶绿素提取量的影响

从表1可以看出，研磨法中不同溶剂对葡萄组培苗叶绿素提取量的影响也不同，整体上混合溶剂的提取效果好于单一溶剂。混合溶剂乙醇∶丙酮＝1:2的提取液提取的叶绿素含量显著高于其余溶剂，在单一溶剂中丙酮的提取效果显著高于乙醇。

2.2 浸提法中提取溶剂及浸提时间对总叶绿素提取量的影响

从表2中可见，从浸提溶剂来看，混合溶剂的提取效果仍显著高于单一溶剂（表 2）。 从浸提时间上，浸提 8h，12h 时，用混合溶剂乙醇：丙酮＝1:2提取的总叶绿素含量高于其余提取溶剂，而 80％丙酮的提取效率最低。 随着浸提时间的增加，混合溶剂的提取效率也逐渐提高。 浸提 20h 以后混合溶剂乙醇：丙酮＝1:1的提取效果显著高于单一溶剂，20h 后 95％乙醇的提取效果与混合溶剂乙醇：丙酮＝1:2相当，这表明在浸提时间短的情况下，浸提溶剂的不同是决定提取效果的关键因素，当浸提时间达到一定程度后，溶剂的影响减小。在试验中宜选用浸提时间20h以上28h以下作为最佳浸提时间，来达到最大的提取效果。

2.3 两种提取方法对葡萄组培苗总叶绿素含量的影响由表1中可见研磨法提取的葡萄叶绿素含量以混合溶剂乙醇：丙酮＝1:2的提取液提取的叶绿素含量最高，可以达到4.29mg/g，而浸提法在浸提24h时用混合溶剂乙醇：丙酮＝1:1的提取液时叶绿素含量最高可以达到4.32mg/g，表明传统研磨法与浸提法提取效果相当，但提取过程优于传统的研磨法。 丙酮与乙醇混合溶剂的提取效果显著高于单一溶剂，不同的浸提时间也影响叶绿素的最终提取量。采用浸提法提取葡萄叶绿素含量时，混合溶剂乙醇∶丙酮＝1:1的效果较好，提取时间以24h为佳。