寒区品种选育岗位

郭修武　陈文玲　郭印山

 

 

三倍体葡萄育种已成为培育无核葡萄品种的新途径。在常规条件下进行二倍体和四倍体品种间杂交，具有严重的杂交障碍，主要表现在杂种胚早期败育，很难获得杂交后代，因此育种效率极低。随着生物技术的发展，人们利用胚挽救技术来阻止三倍体杂交幼胚的早期败育，以提高三倍体杂交后代的获得率。近年来，国内许多育种学家也就利用胚挽救技术培养四倍体与二倍体葡萄杂种胚以培育三倍体植株展开了大量的研究。本研究以二倍体无核葡萄品种与四倍体葡萄品种为亲本分别进行正反交，对获得的杂种胚进行胚挽救，并利用流式细胞仪结合染色体计数法对杂种苗进行倍性鉴定，以期为快速鉴定杂种苗倍性提供理论基础，为今后的多倍体育种提供种质材料与技术依据。

 

1 材料与方法

 

（1）试材及杂交授粉

 

试材取自沈阳农业大学葡萄试验园，以葡萄二倍体品种无核红宝石、四倍体品种香悦为试材，于2012年6月进行杂交。

 

（2）杂交后代胚挽救方法

 

无核红宝石×香悦（正交RX）于花后 45d、50d、55d、60d、65d，香悦×无核红宝石（反交XR）于花后55d、62d、69d、76d、83d取样，果穗经清洗消毒后，将消毒后的果粒切开，取出胚珠，接种于内装50ml胚发育培养基的100ml的三角瓶中，在胚发育葡萄二倍体与四倍体杂交胚挽救后代的倍性鉴定培养基中培养60天后将培养的胚珠横切后转入萌发培养基，30d 后调查萌发成苗率。培养条件为温度(25±1)℃，光强为2000Lx，每天光照12～14h。

 

（3）流式细胞仪检测胚挽救杂交后代倍性

 

流式细胞仪为美国BD公司生产的BD FACSCalibur流式细胞仪，测定供试材料DNA 含量，鉴定杂种幼苗的倍性。取少量新鲜嫩叶在Chopping Buffer缓冲液中剪碎，用300目筛网过滤，滤液于1000rpm，离心10min弃上清，余下的DNA加PI染液染色，避光15min，500目筛网过滤，滤液用标准试管收集，随即上机测定。

 

缓冲液成分：15mM Tris，2mM Na2EDTA，0 . 5mM 精胺，80mM KCl，20mM NaCl，0.1%Triton X-100，15mM二巯基乙醇，去离子水。pH7.5，0.22um滤膜过滤，-20℃冻存。

 

本试验以二倍体无核红宝石为对照，所有测试样品细胞核DNA含量是以对照为标准的相对值。每个样品重复两次，每次检测时至少收集10000个细胞核。

 

（4）染色体计数法检测杂交后代倍性

 

对所获得的二倍体与四倍体杂交后代试管苗通过卡宝品红染色法进行根尖染色体鉴定，以确定其倍性。方法如下：取根尖0.2cm左右 → 预处理2～4h → 卡诺固定12～24h → 盐酸解离10～12min →卡宝品红染色25min→镜检拍照。

 

２ 试验结果

 

 

 

（1）流式细胞仪检测杂交后代倍性结果

 

利用流式细胞仪对2个组合的64株杂种单株新鲜叶片进行测定，以二倍体葡萄品种无核红宝石为对照，将其产生的分析峰在横轴上DNA 含量荧光值 FL设定，固定参数，二倍体品种为 200。依次测定各供试材料 DNA 含量的荧光值，并与设定参数进行对比，结果有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体几种不同的倍性（表1）。其中获得三倍体植株17株，无核红宝石×香悦（RX）杂交后代1株，香悦×无核红宝石（XR）杂交后代16株。以二倍体为母本的杂交组合还获得了50%的二倍体和37.5%的非整倍体。香悦×无核红宝石杂交后代中有63.79%的四倍体和8.62%的非整倍体。

 

（2）染色体计数法检测杂交幼苗倍性结果

 

利用卡宝品红染色法对两个不同的杂交组合所获得的64株杂交幼苗进行染色体计数已知葡萄的二倍体栽培品种染色体数目为2n=38，四倍体栽培品种是2n=76。染色体计数结果与流式细胞仪结果基本一致，出现几种不同情况（图1），分别为二倍体，三倍体，四倍体与非整倍体。

 

 

 

A.RX二倍体杂种植株；B.RX非整倍体杂种植株；C.RX三倍体杂种植株；D.XR三倍体杂种植株；E.XR四倍体杂种植株；F.XR非整倍体杂种植株

 

3 小结

 

利用流式细胞仪结合染色体计数法可以快速、准确鉴定葡萄二倍体与四倍体杂交胚挽救后代的倍性，可以为提高育种效率奠定基础。