质量安全与营养品质评价岗

狄珊珊 朱倩雯 齐沛沛 王新全

 

  1 研究背景

  二硫代氨基甲酸酯（盐）类（DTCs）农药作为广泛应用于水果病害防治的杀菌剂，区别于现代单一靶点杀菌剂，可通过多靶点发挥药效，常以重金属盐的形式存在，主要分为三类，乙撑双二硫代氨基甲酸酯（盐）（包括代森钠、代森锰、代森锌、代森锰锌等）、二甲基二硫代氨基甲酸酯（盐）（包括福美双、福美铁、福美锌等）、丙撑双二硫代氨基甲酸酯（盐）（包括丙森钠、丙森锌等）。DTCs农药因广谱杀菌、成本低，自上市以来广泛用于防治70余种作物的400多种病原菌，尤其在葡萄等水果的霜霉病、炭疽病、黑星病等病害防治中应用普遍，其中代森锰锌2023年全球杀菌剂销量排名第四。

  DTCs农药代谢产物乙撑硫脲（ETU）被国际癌症研究机构列为2B类潜在致癌物，具有致癌性、致畸性和致突变性，长期接触该物质会影响哺乳动物甲状腺功能，代谢产物丙撑硫脲（PTU）也可能导致甲状腺功能异常。DTCs农药对水生生物（虹鳟鱼、大型溞等）毒性普遍较高，例如代森锰锌对虹鳟鱼96 h急性毒性（0.074 mg/L）为“剧毒”。DTCs类杀菌剂应用范围广用量大，现有的水果中DTCs检测标准只能测总量，无法满足对各类DTC农药监测需求，且方法操作繁琐费时，缺乏针对其代谢产物的检测方法。因此建立三类DTCs农药及其代谢物的检测方法十分必要，为葡萄样品中DTCs检测及监管提供支撑。

  2 实验部分

  2.1 实验设备与主要试剂

  三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）、BS 224S和BSA 2202S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、KQ-300DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、stlr plus冷冻型台式离心机（美国Thermo公司）、MS 3digital涡旋振荡机（德国IKA公司）、HR2166搅拌机（飞利浦有限公司）、糖酸计（日本爱拓）。甲醇（色谱纯，Supelco公司）、乙腈（色谱纯，Supelco公司）、氢氧化钠（阿拉丁）、L-半胱氨酸盐酸盐（麦克林）、EDTA-Na2盐（麦克林）、四丁基硫酸氢铵（阿拉丁）、硫酸二甲酯（分析纯，国药集团）、C18（phenomenex公司）、无水硫酸镁（分析纯，国药集团）、PSA（Agela公司）、GCB（先丰纳米公司）、乙酸钠麦克林）、层析硅胶（天辰新材料）。

  标准物质：丙森锌、代森锰锌、代森铵、代森联、代森锌、福美锌、福美双、亚乙基硫脲、丙烯硫脲购自上海曼哈格生物科技有限公司，标准品纯度均≥70%。其结构式如图1A-I所示。用乙腈将各化合物标准品溶解，稀释并定容获得800 mg/L的标准储备液，根据需要用乙腈将储备液稀释至所需浓度。

 

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  氢氧化钠溶液(10 mol /L)：取氢氧化钠40 g，加水使溶解成100 mL，即得。EDTA-2Na碱性提取液：取L-半胱氨酸盐酸盐2.5 g、EDTA-2Na盐46.73 g 和氢氧化钠9 g，加水500 mL使溶解，以10 mol /L 的氢氧化钠溶液调节pH至9～10，即得。本液应在凉处避光保存。四丁基硫酸氢铵溶液：称取13.6 g四丁基硫酸氢铵，加水定容至100 mL。硫酸二甲酯溶液：量取4.88 mL，溶于1 L乙腈中，配制成0.05 mg/kg的提取液。

  2.2. 样品制备

  将新鲜的葡萄用搅拌机打浆和粉碎，分别将打浆后的葡萄装于样品瓶中，保存在-20℃的冰箱中备用。

  选取9个不同特性（颜色、核型、产地、酸度）的葡萄品种进行验证，如表1所示。

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  2.3 样品前处理方法

  2.3.1 甲基乙撑双二硫代氨基甲酸盐和乙撑双二硫代氨基甲酸盐的测定

  取样品10 g(准确至0.01 g)，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入碱性EDTA-Na2提取溶液10 mL，涡旋使样品充分浸润。加入四丁基硫酸氢铵溶液1 mL，混合均匀。精密加入0.05 mg/kg硫酸二甲酯溶液10 mL，置振荡器上剧烈震荡20 min(500次/min)，放置10 min后，加入6 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min(500次/min)，于冰浴中冷却3 min，4000 r/min离心5 min。

  精密移取上清液1.5 mL，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（0.15g MgSO4、0.05g PSA、0.05g C18、0.015g GCB、0.05g层析硅胶）中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡5 min(500次/min) 使净化完全，4000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，用微孔滤膜(孔径0.22 μm)过滤，用于仪器检测。

  2.3.2 二甲基二硫代氨基甲酸酯（盐）类和衍生物的测定

  取样品10 g(准确至0.01 g)，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋使样品充分浸润，加入6 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min(500次/min)，4000 r/min 离心5 min。

  精密移取上清液1.5 mL，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（0.15g MgSO4、0.05g PSA、0.05g C18、0.015g GCB、0.05g层析硅胶）中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡5 min(500次/min)使净化完全，4000 r/min离心5 min，取1 mL上清液，用微孔滤膜(孔径0.22 μm)过滤，用于仪器检测。

  2.4 色谱-质谱分析条件

  色谱柱:Luna Omega C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm)，流动相A：乙腈，流动相B：0. 1% 甲酸水溶液，梯度洗脱程序:0~1 min，40 % A；1~3 min，80% A；3～5 min，95% A；5～7 min，95% A；7.01~10 min，5% A；流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量1 μL。

  质谱系统配备了电喷雾电离（ESI）源。雾化气流量为3 L/min；接口温度300 ℃；DL温度250 ℃；加热块温度400 ℃；干燥气流量10 L/min。数据采集采用多反应监测（MRM）模式，用于定量和定性的离子对以及优碰撞能量（Collision Energy）和保留时间总结在表2中。

 

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  3 实验结果

  3.1 提取条件的优化

  3.1.1 衍生试剂浓度的优化

  本研究针对衍生液浓度展开优化实验，选用硫酸二甲酯溶液作为衍生试剂，探究不同浓度（0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg）对甲基乙撑双二硫代氨基甲酸盐和乙撑双二硫代氨基甲酸盐衍生效率的影响。结果如图2所示，当衍生试剂硫酸二甲酯溶液为0.05 mg/kg时，提取得到的甲基乙撑双二硫代氨基甲酸盐和乙撑双二硫代氨基甲酸盐回收率最高，因此对于衍生试剂硫酸二甲酯溶液浓度选择0.05 mg/kg。

 

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  3.1.2 衍生化反应时间的优化

  为明确衍生化反应时间对甲基乙撑双二硫代氨基甲酸盐和乙撑双二硫代氨基甲酸盐提取效率的影响，进行了相关实验探究。结果如图3所示，当衍生化反应时间大于10 min时，两类化合物回收率均能保持在85%以上，因此本方法衍生反应时间选择10 min，既保证检测结果准确性又可以最大限度节约时间。

 

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  3.1.3 提取液的选择

  实验考察了不同提取液对二甲基二硫代氨基甲酸酯（盐）类和衍生物提取效率的影响，选取乙腈和1%甲酸乙腈作为研究对象。结果如图4所示，乙腈的提取效率更好，因此本方法选择乙腈做为提取试剂。

 

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  3.1.4 QuEChERS盐包的选择

  为筛选出适合二硫代氨基甲酸盐类农药化合物提取的QuEChERS盐包，实验对比了两种不同配比盐包的提取效果，分别为4 g无水硫酸镁与2 g氯化钠组合、6 g无水硫酸镁与1.5 g乙酸钠组合。乙酸钠主要用于调节萃取环境的pH值，增强酸性农药的提取效率，同时辅助去除基质中的干扰物。综合实验结果，故选用6 g无水硫酸镁、1.5 g乙酸钠做为本方法的QuEChERS盐包。

  3.1.5 净化粉的选择

  实验对比了两种不同配比净化粉对二硫代氨基甲酸盐类农药化合物的净化效果，第一种配比为0.15 g MgSO₄、0.05 g PSA、0.05 g C18、0.015 g GCB、0.05 g层析硅胶，第二种配比为0.20 g MgSO₄、0.035 g PSA、0.015 g C18。由于葡萄及其制品的衍生液颜色较深，而GCB（石墨化炭黑）具有良好的脱色效果，加入GCB能够有效去除衍生液中的色素，因此确定第一种净化粉配比为本实验的净化方案。

  3.2 方法学验证

  3.2.1 线性范围与检出限

  通过配制不同浓度的丙森锌、代森锰锌、代森铵、代森联、代森锌、福美锌、福美双、亚乙基硫脲、丙烯硫脲化合物标准工作溶液建立每个化合物的校准曲线来评估线性，绘制不同二硫代氨基甲酸盐类农药化合物的峰面积与浓度的关系得到标准曲线，以各二硫代氨基甲酸盐类农药化合物的峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，相关数据见表3。

 

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  3.2.2 回收率与精密度

  将9个二硫代氨基甲酸盐类农药标准品加标于9种不同品种的葡萄样品中，分别进行0.05（低）、0.2（中）、1.0（高）mg/kg的3个添加水平测试，每个浓度水平重复测定3次，用回收率评价其准确性，回收率计算公式为：回收率（%）=100×（测定量-原始量）/加入量。该方法的的加标回收率基本在60%-130%范围内，仅少数化合物在个别品种低浓度加标时回收率略低于70%，相对标准偏差范围≤15%，结果如表4所示。

 

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  3.3.3 转换系数

  由于国家标准规定二硫代氨基甲酸盐类农药按其酸热裂解产物二硫化碳（CS2）计。本方法需将该测定值换算成CS2来符合国家标准要求。其中，乙撑双二硫代氨基甲酸盐、二甲基二硫代氨基甲酸酯（盐）类相关系数为0.63，（包括代森锰锌、代森铵、代森联、代森锌）；甲基乙撑双二硫代氨基甲酸盐相关系数为0.60（包括丙森锌）。

  4 结论

  本研究针对9个不同特性（颜色、核型、产地、酸度）的葡萄品种验证表明，所建立的检测方法对绿色葡萄品种的适用性最优，三个浓度加标回收率在60%-130%；对紫色/红色葡萄品种，在中、高浓度加标时完全满足检测要求，仅低浓度加标时需注意色素基质干扰，可通过适当增加分散固相萃取中石墨化炭黑（GCB）的用量（当前用量0.015 g，可调整至0.02-0.025 g），增强对紫色葡萄中花青素的吸附能力，减少色素对目标物提取的干扰，进一步提升回收率稳定性。

  与已有的文献方法相比，本方法采用碱性 EDTA-2Na 溶液直接提取目标物，提高了提取效率；使用QuEChERS原理净化，缩短了净化过程；优化建立了2种代谢物色谱-质谱条件及前处理方式，使目标物的定量更准确。

  该方法可适用于不同颜色、核型、产地及酸度的葡萄品种中二硫代氨基甲酸酯类农药残留检测，为不同品种葡萄样品的质量安全分析提供技术支持。