树体病害防控岗位

  传统的葡萄育种方法主要有杂交育种、实生选种、芽变选种、倍性育种、远缘杂交育种、诱变育种等[1]。利用传统的育种方法，选育抗病、虫害的品种或砧木，是目前育种家们选育抗病虫害葡萄品种的常用方法。然而，传统新品种选育过程历时长，耗费大，效率低。通常，一个鲜食葡萄品种从配制杂交组合到品种审定，需要12-20年，而酿酒品种则至少需要15-25年。因而，缩短育种周期、提高育种效率成为葡萄育种技术进步的主要趋势。

  分子育种技术是指对生物内源及外源DNA片段、基因甚至单个碱基通过精确转移或突变而创造新的变异，进而选育或创制新品种的技术。该技术从20世纪90年代开始应用到葡萄育种领域[2]，主要包括分子标记辅助育种技术、转基因技术和基因编辑技术等，能大大缩短育种周期和提高育种效率，已成为葡萄抗病育种的主要研究方向。

  分子标记辅助育种技术

  DNA 分子标记是目前发展最为迅速的一类遗传标记，在葡萄遗传育种方面，随着分子标记技术的不断完善和发展，DNA 分子标记已在葡萄品种鉴定[3]、遗传多样性和亲缘关系分析[4]、遗传图谱构建[5]、重要性状分子标记辅助选择[6]等方面得到了广泛的应用，这将大大提高人们对葡萄遗传分析的准确性和选育种的效率，加速葡萄育种进程。

  葡萄育种DNA标记技术

  葡萄育种的DNA标记技术源于上世纪90年代。当时，其它农作物中的DNA标记技术主要以同工酶标记和限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)为主[7-8]。而葡萄基因组因为高度杂合的特性，其标记技术主要以聚合酶链反应(PCR)的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)为主。1994年，Weeden等人首先利用RAPD技术来标记葡萄高度杂合的基因组[9]。随后，1995年，Lodhi等人发表了第一个基于分子标记技术的葡萄遗传图谱[10]。微卫星DNA(SSR)是葡萄中另外一种应用比较广泛的分子标记技术。相较于早期的其它标记技术，这种标记技术更加稳定可靠，更适合于研究与表型相关的遗传机制[11-13]。近几十年来，研究者们在葡萄中发掘了大量的SSR标记，为葡萄的抗病育种提供了重要的分子基础。在上世纪90年代末开始，SSR技术被首先应用在葡萄的基因分型上，用于鉴定葡萄品种间的亲缘关系[14]。随后，SSR技术被应用到葡萄的遗传图谱作图上[15]。同时，利用各种标记技术，研究人员根据遗传标记和表型之间的关系，将一个或多个数量性状基因座(QTL)定位到该基因座同一染色体的遗传标记旁，从而把复杂的表型用一个或多个遗传标记来表征，为后续的抗病育种提供筛选标记[16]。近来，随着高通量测序技术的发展，利用基因组重测序的方法，可以获得群体内不同个体间的单个核苷酸的信息(SNP)。根据这些SNP信息，同时结合个体的表型测定，利用全基因组关联分析的方法(GWAS)，可以把与对应表型相关的SNP筛选出来，为育种家提供更精细的辅助标记[17]。Meuwissen在2001年提出全基因组选择（Genomic Selection，GS）的分子标记辅助育种方法。与其它低密度分子标记技术辅助育种不同，GS方法利用覆盖全基因组的高密度分子标记进行选择育种。通过构建预测模型，根据基因组估计育种值（Genomic Estimated Breeding Value, GEBV）进行早期个体的预测和选择，从而缩短世代间隔，加快育种进程，节约大量成本[18]。

  该方法在动物及其它植物中进行了较为广泛的应用。最近，随着大规模葡萄品种深度重测序项目的开展，该项技术在不久的将来也将成为葡萄抗病育种的重要方向。

  抗病分子标记

  2001年，Dalbo等人利用一个白粉抗性特异的分子标记来检测葡萄群体白粉抗性的分离情况[19]。2004年，Fisher等人在欧亚葡萄Regent上发现15号染色体上一个抗白粉病的主效的QTL位点[20]。接着，Welter等人在4号和8号染色体上发现两个抗霜霉的QTL位点[21]。另外，Bouquet等人在12号染色体上鉴定了抗白粉病的run1位点，该位点靠近抗霜霉病的位点rpv1[22]. 在另一项基于SSR标记的QTL分析发现，由欧亚葡萄品种F2-35（感白粉病）和复叶葡萄V. piasezkii DVIT2027(抗白粉病)杂交获得的277个F1群体，其包含两个白粉病的抗性位点，Ren6和Ren7，分别位于9号和19号染色体上[23]。

  有研究组利用分子标记的方法，利用北美、中国和亚洲其它地区的野生葡萄资源，对霜霉和白粉病进行QTL定位。在4、7、9、12、13、15和18号染色体上分别定位到了与赤霉素抑制因子 (RGA)家族相关的QTL位点。定位得到的 Run1/Rpv1位点包含多个Toll/白介素-1受体(TIR)-NB-LRR型R基因[24]。侵染实验表明，在这些R基因中，在导入易感葡萄品种过表达后，只有MrRGA10能介导白粉菌的抗性[25]。最近，抗白粉病葡萄品种105/34和感白粉葡萄品种深红无籽杂交后代中，Agurto等人利用分子标记技术，获得了抗白粉病的Run1Ren1基因型杂交后代[26]。这些结果表明，分子标记技术能很好的用于葡萄抗病资源的挖掘，从而为抗病育种提供新的助力。

  抗病分子标记的多基因聚合技术

  葡萄是多年生植物，其生长时间可以超过30年甚至更长，在这期间，抗性的保持对葡萄抗病有着十分重要的意义。最近的研究表明，不同葡萄霜霉菌群体的致病能力产生了较大的分化，在白粉病真菌中也有类似的现象。因为病原菌的快速进化，如果只有单个抗性基因的话，葡萄会很快失去抗病能力。因此，创制多个抗病基因的葡萄新品种对葡萄的抗病育种有着十分重要的意义。Eibach等人把抗性品种VRH3082-1-42(run1/rpv1)和Regent(ren3/rpv3/rpv4)杂交后发现，后代F1个体中包含run1/rpv1/rpv3对白粉病完全免疫[27]。进一步筛选获得run1/run3/rpv1/rpv3是育种家们将来的育种目标。通过聚合Kishmish vatkana中的run1和抗霜霉的葡萄品种Solaris中的rpv10,能获得抗多种真菌的葡萄品种[28]。因此，过杂交育种的方法，利用分子标记辅助技术，获得聚合已有的抗各种病害的分子标记的杂交子代，从而创制出持久抗多种病害的葡萄新品种。

  转基因及基因编辑技术在葡萄抗病育种中的应用

  在葡萄遗传改良中，转基因技术克服了工作量大、随机性高等不足，能快速且有目的地对目标优良性状进行修饰，使其能富集目的基因，逐渐成为葡萄育种研究的热点。然而，葡萄转基因技术受到很多因素的影响，不同的基因型对农杆菌的转染能力存在显著差别，影响了转基因技术在葡萄育种中的应用。目前，在抗病领域，已经有一些葡萄转基因的应用，来提升品种的抗病能力。大多数研究通过改造编码葡聚糖酶和几丁质酶的基因从提升葡萄的抗病能力[29]。另外，通过转基因技术过表达植物抗菌素和二苯乙烯等，也能提升葡萄对真菌的抗性[30]。在细菌抗性方面，葡萄转基因也有比较成功的案例。通过转基因技术，在葡萄中导入抗菌肽基因后能显著提高葡萄抗细菌的能力[31]。另外，通过转基因技术，在葡萄基因组中插入病毒衣壳蛋白(virus coat protein)能增强对GFLV, GVA或GVB等病毒的抵抗能力[32]。

  近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术，已经成为一种十分重要的农作物的遗传改良工具[33]。CRISPR-Cas9基因编辑系统包含Cas核酸酶和CRISPR RNA。Cas9内切酶可以在CRISPR RNA帮助下切割特定的DNA靶位点。这种RNA与Cas9结合，形成RNA介导的核酸内切酶，能在宿主基因组中精确诱导基因突变。然而，CRISPR/Cas9技术的潜在脱靶效应，限制了该技术在葡萄遗传改良中的广泛应用。近年来，国内研究团队在葡萄中成功建立了高效的CRISPR/Cas9基因编辑体系，为实现精准基因组操作提供了有力工具[34]。此外，基于CRISPR/Cas9系统在葡萄中展现的高特异性，该技术在抗逆相关基因的功能解析与分子设计育种方面显示出重要应用潜力[35]。