无核种质材料创制岗位

徐炎 王跃进 张朝红 刘国甜

  优系叶片样品采集，需选健康生长无病虫害、具代表性的植株，选取中上部成熟叶片，避开边缘、病斑处，于生长旺季的上午或傍晚采集，采集后分装到2.0mLEP管中，多准备30%-50%作为备份，标记分类好的叶片立刻在液氮中进行速冻，然后放入-80℃，进行DNA提取，-20℃冰箱保存备用。葡萄双亲SSR核心引物筛选：使用实验室前期验证的57对引物对父母本进行PCR反应，每对引物至少重复3次。初步筛选出父母本具有差异、多态性好、带型清晰的特异性引物。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳（8%非变性）：（1）制胶：用自来水将玻璃板清洗干净，晾干备用，使用前必须是干燥状态；装玻璃板，短板在下，长板在上，短板插入胶条槽子中；底胶封口：50mL蒸馏水+1g琼脂使用微波炉加热，加热至澄清透明状态，沿着胶条缝隙倒均匀，竖着放使底胶凝固，大约10min；所配制的总体积为50mL：分别包括10%过硫酸铵500μL、13.5mL30%制胶液、5mL10×TBE（或者10mL5×TBE）、31.5mL蒸馏水、50μLTEMED（最后加入），所需试剂具体配方如表2-4，迅速摇匀后，立即灌胶至溢出，取出塑料盘梳子，从低板子处插入梳子，注意灌胶时不要有气泡产生，产生气泡应重新灌胶，插完梳子把板子平放在台面上凝固1h以上。（2）放置胶板：胶凝固后，用小刀刮除板子外的溢胶，连同胶条一起安装在电泳槽上（长板朝外），拧好螺丝，在电泳槽里加入一定量的1×TBE缓冲液，看看缓冲液是否有漏液的情况，如有漏液检查是否拧好螺丝了，加到电泳槽中的缓冲液的高度要超过点样孔，电泳槽两端的电泳缓冲液的高度要超过电阻丝的高度。（3）点样：梳子垂直拔出，拔完梳子之后，玻璃板附近有多余的废胶要清理掉，要保证点样孔里没有气泡，如果有气泡用枪头清理掉。点样时每个点样孔里加入0.5μL～2μLPCR扩增产物，在胶的第一个点样孔里加入DNAMarker（100-700bp）。如果DNA样品过多，为了避免所用枪头过多，可以用卫生纸对枪头进行擦拭，确保枪头里没有残留的PCR样品，该枪头可以继续使用。（4）电泳：在100W恒功率、220V恒电压、480mA下电泳45-60mim，具体时间可根据实际情况进行调整，DNAMarker（100-700bp）跑到胶板的2/3处时立刻结束电泳，防止跑过。（5）取胶：停止电泳后，1×TBE缓冲液倒进回收桶，此缓冲液可以重复使用。之后把螺丝拧开取出胶板，胶条取下，用小刀缓慢把两块长短胶板分开，将胶取下，放入提前装有蒸馏水的托盘中，轻轻用蒸馏水清洗胶，把蒸馏水倒掉，下一步银染。（6）染色：加入提前配制好的0.1%硝酸银溶液使用转速为30rpm的摇床染色15min左右，注意染色时间不要过久。（7）漂洗：把染色液倒掉（1L染色液可以染6-8块胶左右，根据实际情况决定染色液倒进废液桶或者回收桶），之后加入蒸馏水清洗胶3次左右，每次清洗的时间约30s，要确保把硝酸银清洗干净，如果清洗不干净会影响后续实验，清洗干净后进行下一步试验。（8）显色：在放有胶的托盘中加入提前配制好的显影液（1L蒸馏水+4mL甲醛），之后迅速放到摇床上，使用转速为30rpm的摇床显色3-5min左右，注意不要时间太久，显色完成后，把显色液倒掉，根据实际情况决定显色液倒进废液桶或者回收桶。（9）洗涤：加入蒸馏水将胶清洗3次左右，把显影液清洗干净。（10）保存：将胶放到胶片观察灯下进行观察，用提前准备好的滤纸吸干胶上的水分，以防拍照时反光，并把胶上的气泡赶出，之后进行拍照记录。