病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 任芳 胡国君 郝雨欣

  植物病毒属Cheravirus属于Picornavirales目Secoviridae科。在国际病毒分类委员会（ICT）发布的2023年最新病毒分类名录中（https://ictv.global/taxonomy），Cheravirus属的成员共有8个，分别为苹果潜隐球病毒（ALSV）、樱桃树叶条纹病毒（CRLV）、花牛蒡病毒B（AVB）、醋栗潜隐病毒（CuLV）、树梅病毒（StPV）、高山野樱桃病毒（AWPV）、高丽万菊Cheravirus（TgCV）和大叶列当草病毒（OcSV）。最近还报告了4种临时Cheravirus属的成员：香槟果Cheravirus 1（BabChV-1）、伞花菊Cheravirus（CvCV）、印度紫薇Cheravirus（LaiCV）和膜蕨囊瓣芹Cheravirus（PtCV）。 

  Cheravirus基因组由两个正义RNA分组成。每个基因组RNA编码一个多聚蛋白，该聚蛋白由RNA1编码的3C蛋白酶（3CLPro）剪切生成功能性非结构和结构白。 RNA1多聚蛋白的加工导致产生五种蛋白，包括蛋白酶辅因子（Pro-Co）、聚酶（Hel）、基因连结蛋白（VPg）、蛋白酶（Pro）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP），而多聚蛋白P2被剪切成四种蛋白，包括1个移动蛋白和3个种外壳蛋白。已经确认cheraviruses可以通过线虫传播。2024年，病毒病防控团队对宁夏地区开展了病毒病调查，采集了部分病样进行了高通量测序，发现了一种新的葡萄病毒，命名为葡萄樱桃锉叶病毒属病毒（GCheV）。

  1 材料和方法

  1.1 试验材料

  2024年9月，在宁夏采集了3个酿酒葡萄样品，其中1个赤霞珠葡萄样品表现叶脉退绿，2个马瑟兰葡萄样品分别表现红叶和退率杂色症状（图1）。采集病叶在液氮中快速冷冻，通过干冰运送至百迈克生物科技公司，进行混样测序。

  1.2 研究方法

  1.2.1 高通量测序和生物信息学分析

  提取叶片总RNA，并使用EpicentreRibo-Zero rRNA Removal Kit（Epicentre，Madison，WI，USA）从总RNA提取物中去除核糖体RNA。然后，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit（Illumina，San Diego，CA，USA）使用核糖体RNA缺失RNA样品构建cDNA文库，该cDNA文库在Illumina HiSeq 4000平台上以成对的150bp测序。比对上的葡萄基因组（PN40024组装12X）的序列，使用hisat软件移除。未比对上的序列通过VirusDetect软件进行拼接和BLAST分析。

  1.2.2 RT-PCR检测

  为了明确哪个样品感染了GCheV，设计了分别扩增GCheV RNA1和RNA2的检测引物，CheP1-1a/1b（5’-ATGATATCAGTGTCCGTCAATC-3’/ 5’-CAGATTCCATAACATGTCCAGG-3’）和CheP2-3a/3b（5’-CGATCCCCACTTCCATTGGTAG-3’/ 5’-CACTGTCTCCAAGGGCATTTCC-3’），扩增片段大小分别为312bp和231bp。

  1.2.3 GCheV基因组扩增及序列分析

  根据contigs序列设计了6对引物，用于扩增GCheV基因组序列。回收、纯化PCR片段，将其克隆到零背景pTOPO-Blunt载体（Aidlab，中国，北京）。每个PCR产物至少3个阳性克隆送上海生物工程技术公司进行了测序。采用SMARTer®RACE 5’/3’Kit （TaKaRa）试剂盒对GCheV的5’和3’UTR进行扩增。

  1.2.4 进化树分析

  为进一步弄清GCheV的分类地位，选择Secoviridae科九个属代表成员RNA1多聚蛋白的保守Pro-Pol结构域的基酸序列（从3CL-Pro的CG基序到Pol的GDD）基序用于构建系统发育树。

  2 结果与分析

  2.1 高通量测序结果分析

  高通量测序产生了64,838,598条数据，通过拼接获得54,724条contigs序列。在NCBI（National Center for Biotechnology Information）的数据库进行本地BLAST搜索时，分别别出两个长度为7337 nt和3590 nt的contigs。这两个contigs的预测翻译产物显示与CvCV（GenBank编号DBA54697和DBA54698）的RNA1多蛋白（58.88％）和RNA2多蛋白（48.94％）具有最高的氨基酸（aa）序列同源性，与其他chervivirus的aa列相似性较低。这些结果表明，葡萄树样本中可能存在一种新的cheravirus。

  2.2 GaMV基因组序列

  为了确定哪个样本被认为是感染了可能的樱桃病毒，采用两对引物CheP1-1a/1b和CheP2-3a/3b进行RT-PCR扩增。凝胶电泳和PCR产物的测序证实，仅在表现出叶脉黄化的赤霞珠葡萄中存在cheravirus。通过分段扩增和RACE扩增，获得了Cheravirus的RNA1和RNA2的完整的基因组序列。RNA1和RNA2的长度分别为7395 nt和3645 nt，不包括它们的poly-A尾巴，其核苷酸序列已经提交GenBank数据库，登陆号为PV067668和PV067669。发现的cheravirus病毒暂定为葡萄樱桃锉叶病毒属病毒（GCheV）。

  2.3 GCheV进化树分析

  为进一步阐明GCheV的分类位置，选择家族Secoviridae中九个属的代表性成员RNA1 多聚蛋白中保守的Pro-Pol结构域的氨基酸序列（从3CL-Pro的CG基序到Pol的GDD基序）以构建系统发生树。结果显示GCheV与CvCV在Cheravirus属中聚类在一起（图3）。