鲜食葡萄品种改良岗位
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验材料为‘瑞都香玉’葡萄品种，采自北京市农林科学林业果树研究所。行距2.5米，株距0.75米露地栽培，倾斜式水平龙蔓，单臂篱架整形。使用常规的栽培管理措施。2024年5月25日，‘瑞都香玉’葡萄开花，花后30d（6月25日）采集果实样品。后每隔15d采样，至2024年8月10日（成 熟 期）止，共4次，分别标记为 S1（幼果期）、S2（膨大期）、S3（转色期）、S4（成熟期）。采样时需要兼顾阴面与阳面，并且每穗葡萄应兼顾肩、中、顶部的位置。将样品用液氮迅速冷冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2 葡萄bHLH基因的鉴定与筛选
首先，我们在Emsembl plants (ftp://ftp.ensemblgenomes.org/)下载葡萄的蛋白数据，并在 PlantTFDB5.0中下载得到拟南芥bHLH转录因子蛋白序列。利用HMMER 3.0软件和本地Blastp方法联合进行检索，HMMER 3.0的限定E值为 1×e-10，Blastp的E值设定为 1×e-5。随后使用NCBI在线网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中 BatchCD-search 来检索bHLH家族的保守结构域，收集所有E值小于0.01的查询结果，即为预测到的葡萄VvbHLH基因。利用序列分析软件DNAMAN 6.0对葡萄bHLH蛋白的保守结构域分析；利用Tbtools软件（v1.098774）进行保守结构域可视化 (Chen et al., 2020)。
1.3 葡萄bHLH基因的染色体定位和共线性分析
借助葡萄基因组的注释信息的(gff3)文件，在染色体中将bHLH基因家族成员进行定位，再利用 Tbtools（v1.098774）的 Gene location visualize from gff3 功能对bHLH基因结构结果进行可视化分析。通过 MCScanX 程序(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2)和 KaKs_Calculator2.0(http://code.google.com/p/kaks-calculator/wiki/KaKs _Calculator)分析基因复制事件 (Wang et al., 2024)，用Tbtools（v1.098774）将葡萄bHLH家族成员以及VvbHLHs和拟南芥AtbHLHs的共线性关系进行可视化。
1.4 葡萄bHLH蛋白的理化性质分析和二、三级结构预测
用在线软件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)分析葡萄bHLH基因家族成员的氨基酸数量、理论等电点、分子质量等理化特性 (Eslami Bojnourdi et al., 2023)。用WOLFSPORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)在线工具对葡萄bHLH基因家族成员进行亚细胞定位预测 (Salih et al., 2021)。通过在线工具SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/)对葡萄VvbHLH蛋白进行蛋白质二级结构预测；利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)网站预测分析葡萄VvbHLH蛋白的三级结构 (Liang et al., 2023)。
1.5 系统进化分析、基因结构与保守基序分析
采用MEGA11软件中的MUSCLE工具对葡萄、拟南芥、玉米、梨树、苹果、毛果杨和水稻物种的bHLH序列进行多序列比对，并通过邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树（Zhang et al., 2021）。使用Evolview在线平台（http://www.evolgenius.info/evolview/#/）对构建的进化树进行修剪和美化。通过GSDS网站（http://gsds.gao-lab.org/）进行基因序列内含子和UTR分析。在MEME在线平台（http://meme-suite.org/tools/meme）进行蛋白质保守基序分析（Zhang et al., 2021）。最后利用Tbtools（v1.098774）按进化树顺序对VvbHLH的系统发育树、保守结构域和基因结构结果进行整合可视化。
1.6 葡萄bHLH启动子顺式作用元件分析
从葡萄基因组文件中提取bHLH家族基因起始密码子上游2000 bp序列作为启动子区域，使用PlantCARE数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行启动子顺式作用元件分析（Zhang et al., 2024c）。通过Tbtools（v1.098774）对分析结果进行启动子元件可视化。
1.7 单萜类物质含量测定
游离态单萜类物质的提取与测定参考Liu等（2022b）的方法。采用自动质谱解卷积鉴定系统（AMDIS）计算保留指数（RIs）并获取质谱信息，通过将质谱分析结果与NIST物质检索谱库进行匹配，并结合物质标准的保留指数进行物质鉴定。葡萄萜类化合物的浓度测定通过标准曲线法进行：参考Zhou等（2022）的方法制备并绘制标准曲线。对于缺乏标准曲线的单萜化合物，采用碳原子数和化学结构相似物质的标准曲线进行定量分析。
1.8 RNA提取与RT-qPCR分析
使用Premier 6软件设计葡萄bHLH家族基因的特异性引物，用天根RNAplant试剂盒（天根，中国）提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计（ND-7000，NanoDrop技术公司，美国）测定RNA的产率和质量。用All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix (gDNA Purge)反转录试剂盒(Novoprotein, China)合成cDNA。将cDNA稀释5倍至200 ng/μL浓度用于RT-qPCR反应。RT-qPCR反应采用SYBR qPCR混合物（GenStar，中国）和CFX连接实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国）进行。PCR循环为：95°C 2 min，40个循环数，95°C 15 s，60°C 34 s。每个反应设置3个生物学重复。以VvUbiquitin作为内参基因，使用2−ΔΔCT方法计算基因相对表达量（Harshitha and Arunraj, 2021）。
1.9 葡萄bHLH基因表达量与单萜含量的相关性分析
基于葡萄果实中单萜含量变化及bHLH基因在不同时期的相对表达量，采用SPSS 27.0软件（SPSS，美国）进行Pearson相关性分析。相关性显著性在P < 0.05和P < 0.01水平进行评估，并使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）法进行多重检验校正。通过ChiPlot在线平台（https://www.chiplot.online/）绘制热图，可视化单萜含量变化与基因表达结果之间的相关性。
1.10 VvbHLH9基因克隆、质粒构建与亚细胞定位
通过逆转录葡萄果实总RNA获得cDNA，并克隆VvbHLH9基因。为确定该基因的真实定位信息，进行了VvbHLH9基因的亚细胞定位分析：构建带有GFP标签的VvbHLH9蛋白重组质粒，通过农杆菌介导法将重组载体注射入本氏烟草叶片，同时以携带GFP标签的空载pCAMBIA2300-GFP载体作为对照。暗培养过夜后，再光照培养12小时。叶片注射约3天后，将叶片制片，使用FV10-ASW激光共聚焦显微镜观察转基因烟草叶细胞中的GFP荧光。其中GFP代表绿色荧光通道，CHI代表叶绿体自发荧光通道，DAPI代表细胞核染色通道（DAPI染色），DIC代表明场通道，Merge代表多通道叠加图像。
1.11 叶片瞬时过表达分析
将VvbHLH9基因片段克隆至pCAMBIA2300-GFP载体中，并使用重组载体进行瞬时过表达分析。选取大小相近、无机械损伤的'Alden'葡萄新鲜叶片进行侵染实验，每个样品侵染6片叶作为6个技术重复，以等量叶片侵染转入空载pCAMBIA2300-GFP载体的农杆菌作为对照组。菌液培养12小时直至OD600为0.6-1.0，使用侵染缓冲液[MES 2.132 g/L，MgCl2 6H2O 2.033 g/L，蔗糖5 g/L，乙酰丁香酮终浓度200 mg/L，pH5.9]调节菌体OD600至0.4，静置4小时。侵染后的叶片在低温避光条件下培养3天，通过RT-qPCR检测VvbHLH9及单萜合成相关基因的表达水平，并通过GC-MS检测单萜类物质含量。
2 结果
2.1 葡萄bHLH基因的鉴定
通过HMMER软件和TBtools本地BLAST分析，我们鉴定出12个符合筛选标准的葡萄bHLH蛋白序列（图1A）。根据染色体定位，将这些bHLH序列命名为VvbHLH1~VvbHLH12。基于保守结构域分析，将葡萄bHLH家族分为bHLH_SF超家族、bHLH-MYC_N、ACT超家族、bHLH_AtAIB_like、bHLH_AtAMS_like、ACT_UUR-ACR-like和bHLH_AtbHLH_like共7种类型。除VvbHLH9外，其余11个VvbHLH蛋白的N端均含有bHLH-MYC_N结构域（图1B）。通过DNAMAN软件对12个葡萄bHLH的HLH保守结构域分析表明，C端HLH结构域富含疏水性氨基酸亮氨酸（L）和脯氨酸（P），其中L高度保守，对维持bHLH蛋白二级结构的稳定性具有重要作用（图1C）。
2.2 葡萄bHLH基因的染色体定位与共线性分析
为探究VvbHLH的进化复制事件，我们分析了其染色体分布与共线性关系。根据葡萄基因组注释gff3文件，鉴定出的12个葡萄VvbHLH基因定位于6条染色体上（图2）。这些基因呈不规则分布，在不同染色体骨架上的分布密度各异：其中2号和15号染色体包含的bHLH基因数量最多（各3个），1号和7号染色体各含2个bHLH基因，3号和11号染色体所含bHLH基因数量最少（各1个）。
共线性分析显示，葡萄bHLH基因中存在两对共线性关系（图3A）：VvbHLH3与VvbHLH10、VvbHLH4与VvbHLH12，推测其通过大片段基因复制形成。为进一步解析bHLH基因间的进化联系，我们进行了葡萄与拟南芥bHLH基因的共线性分析（图3B）。结果显示葡萄中共有8个VvbHLH基因与拟南芥bHLH基因存在共线性关系。其中，VvbHLH6、VvbHLH9和VvbHLH10这3个基因分别与1个拟南芥bHLH基因同源；VvbHLH3、VvbHLH5、VvbHLH11和VvbHLH12这4个基因分别与2个拟南芥bHLH基因同源；VvbHLH4基因与3个拟南芥bHLH基因同源。
2.3 葡萄bHLH家族蛋白的理化性质分析
葡萄bHLH蛋白理化性质分析表明（表1）：其氨基酸长度在468 aa（VvbHLH3）至696 aa（VvbHLH8）之间。12个bHLH蛋白的分子量范围是52,465.4 Da至77,531.46 Da，其中VvbHLH8分子量最大，VvbHLH3最小。等电点（pI）介于5.01（VvbHLH2）到7.93（VvbHLH1）之间，其中11个bHLH蛋白的pI值处于5-7之间，表明大多数葡萄bHLH家族蛋白理论上是酸性蛋白。不稳定系数范围在38.2（VvbHLH7）至66.03（VvbHLH8）之间，表明大多数成员为不稳定蛋白（不稳定指数II > 40）；仅有两个属于稳定蛋白（II < 40），分别为不稳定系数38.2的VvbHLH7和39.48的VvbHLH10。脂肪系数介于67.51（VvbHLH5）到88.52（VvbHLH1）之间。此外，所有bHLH蛋白的GRAVY亲水性指数均小于0，表明这些蛋白主要呈现亲水性特征，但不同蛋白间的亲水性存在差异。亚细胞定位预测显示，大多数bHLH蛋白定位于细胞核，少数定位于叶绿体。
2.4 葡萄bHLH蛋白空间结构分析
通过SOPMA对bHLH氨基酸序列进行二级结构预测分析发现，葡萄bHLH二级结构主要由α-螺旋（Hh）、无规卷曲（Cc）、β-转角（Tt）和延伸链（Ee）组成（表2）。其中无规卷曲和α-螺旋占比最大，β-转角占比最小。α-螺旋数量占比为30.59%（VvbHLH6）至39.18%（VvbHLH9），延伸链结构数量占比为9.10%（VvbHLH12）至13.44%（VvbHLH7），β-转角结构数量占比为1.51%（VvbHLH5）至4.74%（VvbHLH4），无规卷曲结构数量占比为45.22%（VvbHLH9）至54.44%（VvbHLH6）。通过SWISS-MODEL在线平台对葡萄bHLH序列进行三级结构预测分析显示，所有成员的模型匹配相似度均超过30%，且同一亚家族的蛋白结构具有高度相似性，但个体间也存在差异（图4）。
2.5 系统发育分析、基因结构和保守基序分析
为了阐明葡萄与其他植物bHLH家族的系统发育关系，我们将葡萄bHLH基因家族蛋白序列与拟南芥、玉米、梨树、苹果、毛果杨和水稻的bHLH蛋白序列构建进化树（图5）。根据进化关系，不同物种的132个bHLH蛋白一共被分为12个亚族(Group 1-Group 12)，其中最少的Group 11亚族只含有1个成员，最大的亚家族Group 3和Group7有22个成员。葡萄bHLHs的系统发育分析显示，12个VvbHLH蛋白序列可分为3组：Group 3组包含8个VvbHLH蛋白，Group 4组包含3个VvbHLH蛋白，Group 6组包含1个VvbHLH蛋白。从图中可以看出，所有的葡萄VvbHLH基因与梨树、苹果和拟南芥的总是聚在一起，亲缘关系较近，而与单子叶植物玉米和水稻亲缘关系相对较远。
为了更好地分析葡萄的bHLHs，研究进行了单独的发育进化树、基因结构和基序分析(图6)。可以看到, VvbHLHs分为3类，与蛋白系统发育进化树分类一致。可以发现葡萄bHLH家族成员全部具有编码区域(coding sequences, CDS)，除VvbHLH1、VvbHLH2、VvbHLH5、VvbHLH6、VvbHLH8、VvbHLH10和VvbHLH11外都具有非翻译区(untranslated regions, UTR)，不具有的可能是没有注释出来。同时，葡萄bHLH家族成员均含有Motif 1，表明了bHLH家族的相对保守性。此外，包含相同种类保守基序的bHLH成员进化关系较近。根据Motif差异发现，Group 3亚族成员均含有Motif1、Motif2、Motif3、Motif5和Motif7；Group 4亚族成员均含有Motif1、Motif2、Motif3、Motif 5、Motif 7和Motif 8；Group 6亚族成员则含有Motif1、Motif2和Motif 7。推测不同的分支所包含基序的不同可能是 VvbHLHs进化过程中发生功能分化的原因之一。
2.6 葡萄bHLH基因家族成员的顺式启动子作用元件
为了解葡萄bHLH基因的转录调控，本研究利用TBtools软件提取起始密码子上游2000 bp的葡萄家族基因序列，结合PlantCARE数据库分析统计顺式作用元件，手动去除冗余及无关序列后，再使用TBtools软件将结果可视化分析。结果表明，VvbHLHs的启动子中含有的元件类型和数量有所差异(图7)。基因的启动子区VvbHLH基因家族包含很多与非生物胁迫有关的作用元件，比如：昼夜节律响应元件、参与光响应的顺式调控元件、参与低温反应的顺式元件、干旱胁迫顺式响应元件和缺氧特异性诱导元件等(图7)。研究发现，所有的bHLH家族成员均含有光响应元件，推测其功能与光响应通路密切相关。葡萄中激素相关响应元件占比较多，其中脱落酸、茉莉酸甲酯响应元件是最多的，分别有23和24个(图7A)。因此，可以推测 bHLH 基因家族对生长素(IAA)、脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等激素信号的传播有着及其重要的作用。此外，我们发现6个VvbHLH基因（bHLH2、bHLH4、bHLH6、bHLH7、bHLH8和bHLH9）参与植物中玉米醇溶蛋白代谢调节，这表明VvbHLHs参与植物的代谢调节过程(图7A)。
研究进一步分析了VvbHLH启动子中顺式作用元件的数量(图7B)。结果表明，在全部响应元件中，主要响应元件包括Box 4和抗氧化响应元件（ARE），二者在VvbHLH启动子中分别有1-5个和2-4个。光响应元件主要包括Box 4和G-box元件，其中VvbHLH2、VvbHLH9和VvbHLH11中包含的Box 4元件超过3个；VvbHLH5中包含的G-box元件高达7个。激素应答元件主要由脱落酸响应元件（ABRE）组成，其在VvbHLH3、VvbHLH5、VvbHLH9和VvbHLH11中的含量较高，分别为4、6、3和3个。应激反应元件主要为抗氧化响应元件（ARE），其次是防御与胁迫响应元件（TC-rich repeats）元件。其它作用元件主要包括玉米醇溶蛋白代谢调节元件（O2-site）和干旱响应元件（MBS）等。
2.7 葡萄bHLH基因家族表达模式分析
研究通过RT-qPCR技术分析了葡萄果实发育过程中VvbHLH基因的时空表达模式。研究表明，与其他VvbHLH基因相比，VvbHLH2的表达在不同发育时期具有显著的时空动态性，该基因在果实S4时期（成熟期）呈现较高的表达水平（图8）。在12个VvbHLH基因中，有5个基因（VvbHLH4、VvbHLH5、VvbHLH6、VvbHLH7和VvbHLH8）在果实S3时期（转色期）表达量显著升高，该时期正值葡萄转色阶段，推测可能与葡萄单萜类物质的积累相关（图8）。此外，VvbHLH1、VvbHLH2、VvbHLH3、VvbHLH9和VvbHLH10这5个基因在S4时期表达上调，VvbHLH11基因在S2时期（膨大期）表达上调，VvbHLH12基因在S1时期（幼果期）表达上调。这些发现表明VvbHLH基因在葡萄果实发育阶段具有不同的功能。
2.8 单萜含量分析
由于单萜代谢物主要在葡萄果实中积累，因此我们研究了单萜在葡萄果实发育的4个阶段的积累情况。研究鉴定出‘瑞都香玉’葡萄果实的4个发育时期均含有的8个关键单萜代谢物，包括异松油烯、顺式-氧化玫瑰、cis-呋喃型氧化里那醇、里那醇、脱氢里那醇、β-香茅醇、橙花醇和香叶醇。图9的结果表明，8种单萜在S1-S4时期的含量总体呈现上升趋势，尤其在S3-S4时期的增长速度较为急剧。具体来看，除橙花醇外，其它7种单萜的含量在S1-S2时期均呈下降趋势。
2.9 相关性分析
由于‘瑞都香玉’葡萄果实中单萜含量在S3时期(转色期)急剧上升，故采用Pearson相关性分析评估了S1-S4发育阶段单萜含量与12个VvbHLH基因表达水平之间的关系。可以看出，葡萄中bHLH家族成员的基因表达水平之间也存在一定的相关性（图10）。研究发现，VvbHLH1、VvbHLH2、VvbHLH3、VvbHLH9和VvbHLH10均与葡萄果实中单萜含量呈现显著正相关；VvbHLH11则与葡萄果实中单萜含量呈现显著负相关(图10)。具体来看，VvbHLH1对葡萄果实中异松油烯、cis-呋喃型氧化里那醇、里那醇、脱氢里那醇、β-香茅醇和香叶醇含量增长显著正相关(P<0.05)，而对橙花醇含量增长显著正相关(P<0.01)。VvbHLH2对葡萄果实中cis-呋喃型氧化里那醇和里那醇含量增长显著正相关(P<0.05)。VvbHLH3对顺式-氧化玫瑰含量增长显著正相关(P<0.05)。VvbHLH9和VvbHLH10均对异松油烯、β-香茅醇、橙花醇和香叶醇含量显著正相关(P<0.05)，对cis-呋喃型氧化里那醇和里那醇含量显著正相关(P<0.01)。VvbHLH11对脱氢里那醇含量显著负相关(P<0.05)，对顺式-氧化玫瑰含量显著负相关(P<0.01)。
2.10 VvbHLH9的亚细胞定位
为验证VvbHLH9蛋白的预测定位结果，我们成功克隆了VvbHLH9基因的全长CDS序列，将其连接至pCAMBIA2300-GFP载体并转化至GV3101感受态细胞。使用验证成功的农杆菌菌液浸润本氏烟草叶片后观察结果。通过亚细胞定位发现，未插入VvbHLH9基因的绿色荧光蛋白在本氏烟草各细胞器中均有表达，而与VvbHLH9蛋白融合的绿色荧光蛋白仅在细胞核中表达，证明VvbHLH9基因在细胞核中表达并发挥功能（图11）。
2.11 VvbHLH9过表达促进葡萄单萜代谢物合成
为进一步探究VvbHLH9在葡萄单萜合成中的作用，本研究在‘Alden’葡萄叶片中进行VvbHLH9基因过表达实验。可以看出，与未侵染的叶片颜色相比，侵染后叶片的颜色明显变深（图12A）。RT-qPCR数据显示，该基因显著上调了单萜合成关键酶编码基因VvDXS1、VvDXS4、VvTPS31、VvTPS32和VvTPS35的表达（图12B）。葡萄叶片单萜代谢物定量表明，VvbHLH9过表达促进了包括异松油烯、别罗勒烯、cis-呋喃型氧化里那醇、里那醇、橙花醇和香叶醇在内的多种单萜含量的增加，其中cis-呋喃型氧化里那醇和里那醇的增加尤为显著（图12C）。这一结果与前文中VvbHLH9与异松油烯、β-香茅醇、橙花醇、香叶醇、cis-呋喃型氧化里那醇和里那醇含量显著正相关的研究结果一致，表明VvbHLH9正向调控葡萄单萜合成。
