育种方法与技术岗位

  葡萄常规遗传转化体系普遍存在周期长、效率低、操作复杂等问题，相比而言，发根农杆菌介导的扦插茎段转化技术以单芽茎段为外植体具有简便、周期短等优势。同时扦插茎段再生能力强、成活率高，在转基因功能验证中，该方法可快速获得根部阳性植株，便于外源基因表达与功能分析，提升验证效率与可靠性，为葡萄基因功能研究提供了高效技术支撑，具体方法如下：

  1、试验材料与试剂

  （1）选择生长健康的葡萄二倍体枝条，用枝剪将其剪为5-8 cm的茎段，每段至少保留一个芽眼（图a）。该实验使用的发根农杆菌菌株为MSU440，植物载体为pHB；实验中主要用的药品包括LB培养基、硫酸卡那霉素、利福平、MES、氯化镁、乙酰丁香酮等。

  2、实验步骤

  （1）茎段准备：将准备好的葡萄茎段浸泡至水中8 h，沥干后转移至4 ℃培养箱放置48 h，有助于促进扦插后的生根；处理前需对茎段上端进行“封蜡”，提高茎段的存活率（图a）。

  （2）农杆菌活化及收集：将目标载体质粒通过化学转化法导入到MSU440发根农杆菌中。接着，将转化后的农杆菌接种在含有50 mg·L-1 卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1 链霉素（Strep）的LB固体培养基上进行培养。挑选阳性单克隆进行培养，菌液在5000转每分钟的速度下离心10分钟以收集菌体，随后使用含10 mM MES，10 mM MgCl2和100 μM乙酰丁香酮的缓冲液调整菌液的OD600至0.5-0.6。

  （3）茎段发根农杆菌侵染：在茎段下端使用刀片进行纵向切割，形成侧面伤口，以促进菌液渗透（图b）。将处理后的茎段浸入发根农杆菌菌液中，置于负压真空箱内处理30分钟，随后于室温、黑暗条件下继续浸泡24小时（图c）。

  （4）茎段扦插培养：将经侵染处理后的茎段插入预先准备好的土壤基质中，置于25℃的培养室内，在16小时光照／8小时黑暗的光周期条件下继续培养（图d）。培养期间需特别注意维持高湿环境，可通过覆盖透明培养盖以保持茎段湿度，促进生根与植株恢复。

  （5）根部观察：植株多数会呈现先发芽后生根的情况，因此需观察茎段芽点的生长情况（图e）。比较同一时间不同枝条的发根情况，结果显示，与WT相比，经发根农杆菌的茎段根部生长速度更快、数量更多；此外，携带不同目标基因的发根农杆菌在诱导根系生长方面也表现出一定差异，显示出该系统在基因功能研究及胁迫响应分析中的潜在应用价值（图f-h）。