种苗扩繁与生产技术

  摘要：光照在葡萄果实成熟过程及风味化合物代谢中发挥着关键作用。Garnacha Tintorera是一个染色葡萄品种，其果皮和果肉中均积累类黄酮化合物，且表现出组织特异性。为探讨光照对不同组织及生长环境下类黄酮化合物积累的影响，我们于2018至2020年在露天葡萄园和温室条件下开展了一项为期三年的葡萄果穗套袋（转色期前至采收期）实验。结果显示，套袋处理后葡萄果皮中总花色苷和黄酮醇含量显著下降，而果肉中未观察到一致性变化，套袋处理对黄烷醇的影响较小。套袋处理降低了F3’5’H途径生成的花色苷比例，同时增加了所有组织中通过F3’H途径合成的花色苷比例。黄酮醇在果肉中显示出一致的结果，而黄烷醇则表现出相反的趋势，但改变较小。果皮中的光响应生物标志物显示出栽培环境的特异性，而果肉中的生物标志物在两种栽培环境中基本一致。该研究探讨了Garnacha Tintorera葡萄不同组织类黄酮化合物对套袋处理的响应，为优化染色葡萄的栽培提供了新见解。

  关键词：染色葡萄；紫北塞；酚类；光照；套袋；温室

  类黄酮化合物是葡萄果实中重要的次生代谢物，其对颜色、风味、质地和涩味具有重要贡献，被认为是决定葡萄和葡萄酒品质的关键化合物 (Rienth et al., 2021)。葡萄果实中的类黄酮化合物主要由花色苷、黄酮醇和黄烷醇组成。花色苷是形成颜色的主要化合物，其类型、含量和比例与葡萄果实和葡萄酒的颜色密切相关 (Shi et al., 2024a)。黄酮醇是红葡萄酒中花色苷的共色素，有助于稳定颜色，同时作为光保护剂减少葡萄果实中的紫外线损伤 (Li et al., 2025)。黄烷醇是葡萄单宁的基本组成单位，负责葡萄酒的苦味和收敛性 (Koyama et al., 2017)。

  类黄酮化合物的浓度和组成受遗传因素调控，同时也受到光照、温度、水分、土壤成分和栽培管理等环境因素的影响 (Shi et al., 2024b; Vilanova et al., 2015)。其中，光照是关键的环境调控因子，直接影响葡萄果实的成熟和风味代谢物的生物合成 (Li et al., 2024)。研究表明，遮荫和低光照条件会延缓葡萄果实的成熟(Ghiglieno et al., 2020；Zha et al., 2019)。黄酮醇是光敏性化合物，光照可促进黄酮醇代谢基因的表达，从而正向调控黄酮醇的生物合成 (Friedel et al., 2016)。关于光照对花色苷积累的影响，研究结果存在差异：部分研究指出光照会降低花色苷浓度或无显著影响 (Ristic et al., 2007；Sun et al., 2019)，而另一些研究则认为花色苷主要受非光照因素调控 (Blancquaert et al., 2019)。对于黄烷醇，光照对总黄烷醇浓度的影响也无一致趋势 (Lu et al., 2022)。此外，光照还影响类黄酮化合物的组成，主要通过差异性调控类黄酮3’-羟化酶（F3’H）和类黄酮3’5’-羟化酶（F3’5’H）的生物合成途径 (Guan et al., 2016; Li et al., 2024)。在葡萄栽培中，各种葡萄园管理实践可改变光照条件，进而影响浆果代谢物，包括树冠管理（枝条修剪、叶片去除），地面管理（覆盖物、作物覆盖），人工光照调节（遮荫和补充光照）等。套袋处理是一种广泛采用的田间保护措施，可提升果实颜色和品质，减少机械损伤，并防范病原体、害虫及鸟类侵害。此外，套袋还能有效改变果实光照环境，防止果皮日灼 (Ma et al., 2023; Pisciotta et al., 2020)。果实套袋对葡萄浆果的影响受多种因素影响，包括套袋材料、套袋时间与持续时间、外部环境条件以及套袋时果实的物候阶段 (He et al., 2022; Luca et al., 2023)。不同类型的袋子具有不同的光透射特性，因此套袋是一种研究光照对果实组成的影响有效的实验方法。

  对于大多数红葡萄品种而言，花色苷主要积累在果皮中。但染色葡萄(teinturier)能够在果皮和果肉中积累花色苷 (He et al., 2010)，其颜色更深且总花色苷含量高于非染色葡萄品种 (Tian et al., 2021)。染色葡萄的果皮和果肉组织中含有类似的类黄酮化合物，但某些花色苷的比例具有组织特异性。果皮中含有更多三羟基取代的花色苷，而二羟基取代的花色苷则在果肉中较多 (He et al., 2010b)。除花色苷外，染色葡萄的果肉也能积累黄酮醇和黄烷醇 (Chen et al., 2018)。这些化合物主要用于提升红葡萄酒的色度和品质，在葡萄酒调配中展现出巨大潜力 (Wang et al., 2019)。

  Garnacha Tintorera (Vitis vinifera L.)，又称‘紫北塞’，是一种染色葡萄，主要用于红葡萄酒混酿中的着色增强 (Falginella et al., 2012)。Garnacha Tintorera葡萄果皮和果肉中的类黄酮化合物组成需要进一步研究。此外，光照对不同组织中类黄酮化合物浓度和比例的影响也相对缺乏研究，果肉中的光响应模式是否与葡萄皮中观察到的模式一致，需要进一步探索。本研究在2018年至2020年连续三年中，对Garnacha Tintorera葡萄果穗从转色期至采收期在两种不同光照环境（露天葡萄园与温室）下进行套袋处理，以调节果实光照条件。研究探讨了光照对葡萄中类黄酮化合物组成的影响，并鉴定了果皮与果肉中具有光响应特性的类黄酮合物。此外，我们对Garnacha Tintorera葡萄在不同栽培环境下的组织特异性光响应进行了特征化。本研究旨在探讨在不同生长条件下，果穗套袋处理对Garnacha Tintorera葡萄果皮和果肉中组织特异性类黄酮代谢的影响，为染色葡萄中类黄酮的光调节机制提供新的见解。

  1 材料与方法

  1.1 植物材料与实验设计

  该为期三年的实验（2018–2020）在中国农业大学上庄实验站（40°14’ N, 116°19’ E，海拔50米）进行。试验地属于暖温带半湿润季风气候，土壤为壤土。Garnacha Tintorera葡萄树分别种植于露天葡萄园及玻璃温室（透光率80%）。对于露天葡萄园，Garnacha Tintorera葡萄树于2014年定植，呈南北走向，株行距为2.5 m×1.2 m。，叶幕的整形方式为改良的VSP形（M-VSP），每延长米留芽量为12-15个。对于温室，Garnacha Tintorera葡萄树于2014年定植，呈南北走向，整形方式为龙干形，每个定植位种植两棵葡萄树，株行距为4.0 m×2.5 m。葡萄藤的枝条向东西方向延伸，新梢每延长米的留梢量为80个。管理措施，包括灌溉、营养和病虫害防治，均按照当地标准进行。

  套袋处理在葡萄园和温室中均于葡萄E-L 33采收后开始进行，并持续至葡萄成熟，未处理的葡萄作为对照组。每个果穗被包裹在双层牛皮纸袋中（38 cm × 26 cm），外层为黄色，内层为黑色并涂有蜡层。袋底固定一根吸管以保持通风。对于每个处理组，从树冠两侧随机选取90个葡萄果穗，并设置三个生物重复。在以下生长阶段采集健康葡萄：绿果期（E-L 33）、转色开始（E-L 35）、转色中期（E-L 36）、转色结束（E-L 37）及采收期（E-L 38）。对于每个重复，从每个采样点随机采集200粒浆果。其中100颗浆果用于理化指标检测，剩余样品立即在液氮中冷冻，并保存在-80 °C冰箱中以备后续分析。

  1.2 气象与微气候数据

  气象数据包括生长季节内的温度（°C）、有效积温（GDD，°C）、日照时数（h）和降雨量（mm），来自中国气象数据共享服务系统（http://cdc.cma.gov.cn/）。对于微气候，我们安装了太阳辐射（SR）传感器（S-LIB-M003，Onset，USA）、光合有效辐射（PAR）传感器（S-LIA-M003，Onset，USA）以及温湿度传感器（S-THB-M002，Onset，USA），以监测葡萄果穗的微气候。微气候监测站位于果穗区，传感器探头朝上放置。对于处理组，微气候监测站与果穗同样的袋中，以检测袋内微气候变化，位于相同高度但未包裹袋的微气候监测站作为对照组。气象数据通过HOBO微型站（H21-002，Onset，USA）以15分钟间隔进行记录。

  1.3 浆果理化参数测定

  对于每个生物学重复，随机选取100粒浆果进行称重，随后将浆果压榨以获取果汁。总可溶性固形物（TSS，°Brix）采用数字手持式折光仪（PAL-1，Atago，Japan）进行测定，果汁的pH值则通过pH计（Sartorius PB-10，Germany）测定。果汁的可滴定酸度（TA，g/L）使用0.05 mol/L NaOH进行滴定，以pH 8.2为终点，并以酒石酸当量表示。

  1.4 类黄酮物质分析

  葡萄果实类黄酮物质的提取和检测采用实验室统一方法 (Liang et al. 2012; Li et al., 2017))。

  2 结果与分析

  2.1 气象条件与微气候

  2018年至2020年实验站点的气候条件如表1所示。2018年的温度和有效积温积温（GDD）高于2019年和2020年，但日照时数呈现相反趋势。降水主要集中在7月和8月，其中2018年的降雨量（最高达510.9 mm）远高于其他两年。2018年高降水量导致葡萄园种植的葡萄果实成熟期相对延长。而2019年日照时数最高、降水量最低，因此相较于其他两年更为干燥。

  葡萄园和温室的微气候如图1所示。袋子能完全阻隔太阳辐射（SR）和光合有效辐射（PAR），确保光线无法穿透袋子。在葡萄园中，袋子外温度范围为19.8至31.9 °C，袋子内温度则在20.3至33.7 °C之间波动。在温室中，袋子内外温度分别为22.4-33.2 °C和22.7-32.9 °C，相比葡萄园具有更好的保温效果。这导致温室中葡萄的物候发育明显较早。在葡萄园中，袋子内部温度在大多数时间内高于外部，而在温室中未观察到同样规律。就湿度而言，范围为34.1-100%，不同试验地点和处理组之间无显著差异。此外，就物候阶段而言，套袋处理导致葡萄发育延迟，而采收日期基本不受影响。综上所述，套袋处理有效阻隔阳光照射，同时未对葡萄串的其他微气候参数造成显著改变。

 

  2.2 葡萄的理化指标

  不同处理条件下葡萄的理化指标如图2所示。采收时，葡萄园种植的葡萄百粒重高于温室的葡萄，而套袋处理组葡萄在2018年和2020年的百粒重均低于对照组。对于葡萄园中的对照组葡萄，2019年的百粒重显著低于其他两年，这可能与该年降水量较低有关。在转色期，套袋葡萄的可溶性固形物含量（TSS）高于未套袋的葡萄，但收获时差异不再明显，仅有少数例外。pH值随着果实发育增加，且套袋葡萄的pH值高于对照组。所有葡萄浆果的总酸度（TA）在E-L 35阶段达到峰值，随后随着果实成熟而下降。此外，套袋葡萄的TA低于对照组，差异在E-L 35至E-L 37阶段更为显著，但在收获时逐渐减小。综上所述，在转色期，套袋葡萄的TSS高于对照组，但TA低于对照组。

 

  2.3 葡萄果实发育过程中类黄酮化合物的积累动态

  作为一个染色葡萄品种，Garnacha Tintorera葡萄果实在果皮和果肉中均积累类黄酮化合物。为研究Garnacha Tintorrra葡萄果实在不同组织中类黄酮化合物的积累模式，进行了主成分分析（PCA）（图 3），PCA能够区分不同发育阶段的葡萄，从载荷图中可以看出，黄烷醇是发育早期阶段的主要化合物，而花色苷和黄酮醇的含量随着果实的发育而增加。PCA显示在第2和第4象限中存在明显的组织特异性分离，葡萄果实发育过程中果皮与果肉之间的类黄酮化合物差异逐渐明显。

 

  2018年至2020年间，Garnacha Tintorera葡萄果实皮和果肉中花色苷、黄酮醇和黄烷醇的积累情况如图4、5所示。随着葡萄果实发育，花色苷持续积累并在采收时达到峰值。果皮花色苷在E-L 36后迅速积累，而果肉花色苷在E-L 35后开始快速积累。与对照组相比，套袋处理显著降低了果皮花色苷的积累（2018年葡萄园除外），且温室的葡萄差异更为明显，而果肉花色苷的积累模式并不一致。在葡萄果实发育的各个阶段，果皮花色苷的浓度均低于果肉。此外，在采收期，温室栽培的葡萄果皮花色苷浓度高于葡萄园栽培的葡萄。

  随着果实的发育，黄酮醇的含量持续增加，如图4、5所示。在采收时，套袋处理显著降低了果皮中的黄酮醇含量，而果肉中未观察到显著差异。值得注意的是，在2019年的葡萄园中，自套袋开始以来，黄酮醇的含量就显示出显著差异。采收期，Garnacha Tintorera果肉中的黄酮醇浓度高于果皮。

 

  黄烷醇随着浆果发育呈现大致下降趋势，在 E-L 33 阶段浓度最高。在果实发育期，套袋处理对Garnacha Tintorera果皮和果肉中黄烷醇的积累具有一定影响，但收获时差异缩小。果皮中的黄烷醇浓度在不同年份间表现出显著差异性，2018年的浓度水平明显低于其他两年，而2019年则呈现最高浓度。然而，果肉中的黄烷醇仅在2018年收获时浓度低于其他两个年份。此外，在2019年和2020年的整个发育期内，果皮中的黄烷醇含量始终高于果肉，但这一模式仅在2018年采收期观察到。

 

 

  2.4 套袋处理对Garnacha Tintorera葡萄果实类黄酮化合物组成的影响

  为研究袋装处理对Garnacha Tintorera葡萄在采收时类黄酮化合物浓度及分布的影响，进行了双因素方差分析（ANOVA）。在Garnacha Tintorera葡萄中检测到20种花色苷，根据其花色素单元将其分为五类：花青素（Cy）、花翠素（Dp）、甲基花青素（Pn）、甲基花翠素（Pt）和二甲花翠素（Mv）。在花色苷衍生物中，Mv衍生物是Garnacha Tintorera果皮中含量最高的成分，其次是Pn衍生物，而Cy衍生物的含量在采收时低于其他衍生物。在果肉中，Pn衍生物的浓度最高，其次是Mv衍生物，Dp和Pt衍生物仅占很小比例。年份和套袋处理影响了果皮和果肉中花色苷衍生物的浓度。总体而言，套袋处理降低了Dp、Pt和Mv衍生物的浓度，但2018年葡萄园的果皮除外，而Pn衍生物在套袋后增加。与其他花色苷不同，Cy衍生物在不同年份和组织中的结果不一致，且葡萄园中对照组与套袋处理组之间无显著差异。此外，F3’5’H路径的花色苷浓度在套袋处理后显著降低，而F3’H途径花色苷则呈现相反趋势。套袋处理还改变了花色苷组成比例的变化。套袋处理后，Garnacha Tintorera的果皮和果肉中Mv衍生物的比例均下降，而Pn衍生物的比例增加，其他衍生物的变化则较小（图6a）。相应地，通过F3’5’H途径生物合成的花色苷比例减少，而通过F3’H途径合成的花色苷比例增加。

  基于生物合成途径和分子结构，黄酮醇被分类如下：来自F3’5’H途径的杨梅酮（My）、西伯利亚落叶松黄酮（La）和丁香亭（Sy），来自F3’H途径的槲皮素（Qu）和异鼠李素（Is），以及来自黄烷酮3-羟化酶（F3H）途径的山奈酚（Ka）。My和Qu的衍生物是黄酮醇的主要成分，其中杨梅酮-3-O-半乳糖苷、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷的浓度显著高于其他黄酮醇。此外，黄酮醇在果皮和果肉中的差异积累反映在La和Is衍生物的相对比例上，果皮中La衍生物的比例较高，而果肉中Is衍生物的比例较大。Qu和Is衍生物的浓度和比例在袋装后均有所增加，同时F3’H途径的贡献也随之上调，而其他衍生物在果肉中的趋势则大致相反。然而，在果皮中，葡萄园和温室条件下的结果存在差异。

检测到六种基本单体（儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表儿茶素没食子酸酯（EGC）、表棓儿茶素（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）），其存在形式包括游离单体、末端单元和延伸单元。C是黄烷醇的主要成分，占总黄烷醇浓度的90%以上。与花色苷和黄酮醇相比，套袋处理对黄烷醇的影响相对较小，表现为果肉中GC和EGC浓度降低，以及果皮中EGCG浓度降低。在合成路径方面，黄烷醇的组成显示F3’H的贡献略有下降，同时F3’5’H略有增加，这与花色苷和黄酮醇的情况相反。

 

  2.5 Garnacha Tintorera葡萄果皮和果肉中具有光响应特性的类黄酮化合物

  为了研究Garnacha Tintorera葡萄果皮和果肉中具有光响应特性的类黄酮化合物，采用正交偏最小二乘法结合判别分析（OPLS-DA）对葡萄园和温室中采收时的Garnacha Tintorera类黄酮化合物数据集进行了分析，如图6b所示。结果显示，套袋处理组与对照组样本可被清晰区分，其中VIP值大于1.0的化合物被视为光响应标志物，并通过UpSet图（图6c）进一步可视化。花色苷和黄酮醇是主要的光响应化合物，而在黄烷醇中，仅果肉中的GC和EGC表现出光依赖性积累。在果皮中，光响应生物标志物呈现出明显的环境依赖性模式，其中黄酮醇在葡萄园中是主要标志物，而花色苷在温室中占主导地位。这导致两个实验地点的标志物谱存在显著差异，而果肉中的标志物则基本相同。My-gluc、Qu-gala、Qu-rut、La-gluc和Pn-ace在葡萄园和温室中均被筛选为果皮特异性标志物，其中四种黄酮醇标志物在遮光处理后浓度下降，而Pn-ace浓度上升。GC、EGC、F3’H-黄烷醇、F3’5’H-黄酮醇和Cy-caf是果肉特异性标志物，其浓度在套袋处理后降低。此外，不同种植地点的Garnacha Tintorera葡萄果实显示出不同的标志物，Ka-glu、Qu-glu、Pn-glu、Kas和 F3H-黄酮醇被识别为葡萄园特异性标志物，而My-gala和Dp-coum则为温室葡萄的特有标志物。值得注意的是，My-glu、Sy-glu和Sys在所有实验地点和组织中对套袋处理表现出一致的敏感性，其浓度在袋装后均有所下降。

  2.6 光照指标与Garnacha Tintorer葡萄果皮和果肉中类黄酮化合物的相关性分析

  为研究光照对Garnacha Tintorera葡萄果皮和果肉中类黄酮化合物的影响，对其与两个光照指标PAR和SR进行了相关性分析（图7）。Garnacha Tintorera葡萄中与SR和PAR相关的类黄酮化合物主要由花色苷和黄酮醇组成。通过F3’5’H路径合成的花色苷在所有实验地点和组织中均与PAR和SR呈正相关，其浓度在遮光处理后下降。而Pns和F3’H-花色苷与光照指标呈负相关（温室中的果肉除外）。对于黄酮醇，果皮和果肉中的Is衍生物与PAR和SR呈负相关。此外，在果肉中，Qus和F3’H-黄酮醇也与PAR和SR呈负相关，这表明在光照排除条件下，通过F3’H途径合成的黄酮醇浓度增加。相反，其他大多数黄酮醇在套袋处理下浓度降低，并与光照参数呈正相关。大多数黄烷醇（除ECG外）与光参数呈正相关，但它们之间的弱相关性表明，套袋处理对黄烷醇浓度的影响微乎其微。

 

  3 结论

  本研究评估了不同栽培环境下果穗套袋处理对不同组织中染色葡萄（Garnacha Tintorera）类黄酮化合物的影响。研究结果表明，套袋处理显著延缓了葡萄果实的转色进程，但对采收日期无显著影响。花色苷和黄酮醇表现出较强的光依赖性调节，而黄烷醇对光的响应较弱。套袋处理后，果皮中总花色苷和黄酮醇的浓度下降，而果肉中未观察到一致的模式。套袋处理降低了F3’5’H路径花色苷的比例，同时增强了不同组织中F3’H途径合成的花色苷。黄酮醇仅在果肉中表现出此类模式，而果皮黄酮醇呈现环境依赖性响应，黄烷醇则表现出相反结果，但影响较小。在果皮中，光响应生物标志物在葡萄园中主要为黄酮醇，而在温室中则以花色苷为主，而果肉生物标志物在两种栽培环境中保持一致。大多数类黄酮化合物与光照参数SR和PAR呈正相关，而特定化合物则呈现负相关： Pn衍生物、F3’H-花色苷、Is衍生物和ECG在果皮和果肉中均表现出负相关，而Qu衍生物和F3’H-黄酮醇在果肉中也表现出负相关。我们的研究探讨了果穗套袋对Garnacha Tintorera葡萄在不同环境下组织特异性类黄酮化合物谱的影响，为优化染色葡萄的栽培和利用提供了参考。