种质资源收集与评价岗位，

姜建福 樊秀彩 张颖 孙磊 刘崇怀

  葡萄是世界范围内栽培最广泛的树种之一，在全球水果生产中占有关键地位。葡萄果肉的质构是决定葡萄果实商品品质的关键因素，也是葡萄育种工作者的重要目标。本研究使用刺穿法分析了437个葡萄品系的浆果质地特征。研究结果表明，葡萄品系的五个质地参数之间存在显著的相关性。通过GWAS分析2,124,668个群体SNP，发现了369个与葡萄浆果质地显著相关的SNP位点。通过对这些位点的基因注释和表达分析，确定了几个可能与浆果质地相关的基因，包括E13A、FIS1A、CML35、AGL2和AGL62。基于基因表达分析，E13A、FIS1A和CML35被认为与葡萄浆果质地的关系更为密切。进一步的研究通过瞬时转化技术表明，过表达E13A和CML35显著改变了葡萄果肉的质地。在这项研究中，对437个葡萄品种的果实质地进行了全面评估，并基于全基因组关联研究（GWAS）和基因功能分析筛选出几个重要的候选基因。这一发现为未来关于葡萄果实质地的研究和育种工作奠定了基础。

  1 材料与方法

  所有试验材料均取自中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质郑州葡萄圃，共计453份。于2023年7-10月，每天上午7-9时进行试验品种的采集，每个品种以每棵树作为一个重复，共3组重复，每个品种随机选取10个果粒进行测定，果粒放在标记好的自封袋内后迅速带回实验室并在1天内检测完成。

  葡萄果实质地测定使用的仪器为TA.XTplus质构仪，使用2mm直径P/2针状探头，主要参数设置如下：测前速度为1mm/s，贯穿速度1mm/s，测后速度10mm/s，穿刺深度7mm，负载触发力5g。在测试时从果穗中取下保留短果柄的果粒，将葡萄果粒放置于质构仪的载物平台上，用手稍稍固定，但不压迫到果实，穿刺时探针不要接触到种子，以免影响测试结果。测试的相关指标包括：果皮硬度，果皮破裂距离，果皮韧性，果肉脆性，果肉硬度。

  全基因组关联分析（GWAS）运用GEMMA算法（GEMMA）对团队前期筛选获得的高质量SNPs标记与试验测定的5个葡萄质地表型性状进行标记-性状的全基因组关联分析。根据浆果质地性状显著关联的SNP标记在葡萄参考基因组中的物理位置，筛选显著SNP位点附近的候选基因。利用EnsemblePlants数据库及美国国立生物技术信息中心数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）对候选基因进行功能注释和预测。

  2 结果与分析

  2.1 浆果质地的表型分析

  本研究选取了包含437个葡萄品种（包括鲜食和酿酒类型）的自然种群进行分析（见表1)。研究测量并统计评估了葡萄的五个关键质地特征。437个葡萄品种的果皮硬度范围为1.173至9.089牛顿，平均值为3.488牛顿。“翠红”和“白粉”葡萄的果皮硬度最高。果皮破裂距离较大的葡萄均为鲜食葡萄，其中最大的是麝香紫葡萄。鲜食葡萄的果肉最脆，“翠红”品种最为脆。所有测试材料的果肉硬度范围为0.091至1.843牛顿，平均值为0.476牛顿。欧亚种的果肉硬度高于欧洲和美洲杂交种。变异系数（CV）值显示了各性状之间的显著差异。果皮硬度的变异系数最低，为0.342；而果肉脆性的变异系数最高，达到1.185。

  2.2 浆果质地性状的相关分析

  研究结果表明，果皮硬度与果皮韧性和果肉脆性之间存在高度正相关，相关系数分别为0.92和0.77。表明，葡萄的果皮硬度增加时，果皮韧性也随之增强；果皮硬度越大，咬葡萄时的咬合力越小，脆性也越大。果肉的脆度与果皮的韧性（0.75）显著正相关，但与果肉的坚实度相关性较低图2）。对葡萄品种的分析表明，五个测量的质地参数中，大多数都具有高度或极显著的相关性，突显了葡萄浆果质地作为各种相互关联特征的集合的多面性。

  2.3 基于Berry纹理特征的聚类分析

  根据对五个质地特征的分析，葡萄被分为四个组（I、II、III、IV)。第一组包括41个品种，如“金麝香”。该组的果皮硬度、果皮韧性和果皮断裂距离较大，且欧亚种的比例较高（图3）。第二类包括106个品种，如“CrimsonSeedless”和“Gold”，大多数为鲜食品种。第三组包含57个品种。第二组和第三组的五个质地特征处于中等水平。第四组包含233个品种，其中果皮硬度、果肉断裂距离和果肉脆度较低。

  2.4 浆果质地的GWAS

  以PNT2T葡萄基因组为参考，通过结合437个葡萄品系，建立了一个稳定的群体。经过原始数据的质量控制和筛选，最终形成了包含2,124,668个SNP变异的数据集。利用MLM模型分析了5种葡萄果肉质地与437个葡萄品系的SNP之间的关系。通过GWAS使用MLM模型，共鉴定出369个SNP，这些SNP分布在除染色体1、2、5、12和17外的所有葡萄染色体上，并与五种浆果质地性状显著相关。通过基因注释初步筛选出12个基因，这些基因包括受体激酶、转移酶、糖苷酶、氧化还原酶、转运蛋白、结合蛋白等。

  其中，13个SNP标记与果皮硬度显著相关，4个SNP标记与果皮韧性显著相关。共有94个与果皮断裂距离显著相关的标记位于七个染色体上，这些SNP能够解释果皮断裂距离表型变异的4.3%至6.7%（见图5A)。在11号和15号染色体上分别发现了两个SNP峰，编号为11_3126218和15_15166809。此外，共有199个SNP位点与果肉脆性显著相关，这些位点分布在七个染色体上。这些SNP解释的表型变异（PVE）范围从4.3%到6.8%。研究共识别出58个与该性状相关的潜在SNP位点，这些SNP分布在六个染色体上，占肉质硬度表型变异的4.3%至5.5%。7号和16号染色体上的显著SNP仅与肉质硬度相关。其中，18号染色体上的18_22038237和18_21756428是最显著的标记。

  2.5. 浆果发育阶段候选基因的表达

  在果实发育过程中，‘赤霞珠’和‘翠红’的可溶性固形物（SSC）含量持续上升，且‘翠红’的SSC含量在整个发育过程中一直高于‘赤霞珠’。二者的果皮硬度和果肉脆度变化一致，先增加后减少，在E-L 34迅速达到最大值。在整个果实发育过程中，‘翠红’的果皮硬度和果肉脆度显著高于‘赤霞珠’。果肉的硬度在整个发育期间持续下降，而果皮断裂距离的变化趋势相反，且‘翠红’的质地参数始终高于‘赤霞珠’（图6）。

  通过qRT-PCR进一步验证了候选基因在五个时期中的表达情况。E13A的表达在‘赤霞珠’的过熟期达到最高，并在‘翠红’的收获成熟期达到峰值。同样，FIS1A在‘赤霞珠’和‘翠红’中的表达也呈现出逐渐增加的趋势，在浆果收获成熟期达到最大值，这一趋势与浆果果皮硬度的下降相吻合。CML5在‘赤霞珠’中的基因表达基本与果皮硬度和果皮韧性的变化趋势一致，表现出先升后降的趋势。AGL2的表达水平在‘翠红’的过熟期和‘赤霞珠’的果实闭合期达到最高（图7）。AGL62的表达水平在‘翠红’成熟期和‘赤霞珠’软化期最高。由于E13A、CML35和FIS1A基因表达水平与浆果质地变化呈相似趋势，推测这三个基因可能与浆果质地相关，因此选择这三个基因进行后续瞬时表达实验。

  2.6 候选基因的瞬时表达

  在发育过程中，E13A、CML35和FIS1A基因的相对表达水平相似，并且这些基因与浆果质地的变化密切相关。与对照组相比，过表达E13A和CML35的果实表皮破裂距离和韧性显著增加（图8a、b）。在质地方面，E13A和CML35的过表达也显著提高了果肉的脆度（图8c)。同时，将E13A基因瞬时转入果实后，果肉的硬度显著下降（图8d)，这一结果与qPCR检测一致，表明E13A基因的表达水平随果肉硬度的降低而增加。遗憾的是，在此瞬时转化过程中，FIS1A对浆果质地的影响并不显著。

  3 结论

  本研究通过穿刺法评估了多种葡萄品种的质地特征。结合果肉质地的表型数据与我们之前的人群基因组测序结果，进行了全面的全基因组关联分析（GWAS）。通过GWAS、表达分析和瞬时表达技术，确定了与葡萄果肉质地相关的两个关键候选基因E13A和CML35。这一发现为改善葡萄质地提供了宝贵的见解，并为育种计划中硬果肉葡萄品种的开发奠定了基础。