加工与综合利用

兰义宾

  1 研究目的意义

  我国葡萄酒产区众多，每个产区都有鲜明的生态特征。其中，宁夏贺兰山东麓产区和新疆产区气候干旱、昼夜温差大，产区的葡萄酒果实的含糖量普遍偏高，产生的葡萄酒的酒精度偏高（14-16% v/v），这会导致苹乳发酵的迟滞和中止。葡萄酒苹乳发酵可以通过自然发酵或接种选定的乳酸菌发酵剂启动发酵。葡萄酒乳酸菌发酵剂可以缩短苹乳发酵的时间，同时丰富葡萄酒的风味，并且在野生细菌菌株中占据主导地位，减少不良风味产生。常选用酒酒球菌或植物乳杆菌两种菌株作为发酵剂。酒酒球菌对葡萄酒环境的具有高度耐受性，是葡萄酒苹乳发酵的常用菌株。随着植物乳杆菌的酿酒特性和对葡萄酒的风味影响的研究不断增加，除了完成苹乳发酵，植物乳杆菌还具备能够影响葡萄酒风味的广泛酶谱。经过前期研究的菌株筛选、耐受性评估、发酵应用和风味轮廓分析，植物乳杆菌C10与酒酒球菌VP41混合菌株苹乳发酵速率快，贡献浓郁的新鲜果香风味。本研究将进一步探究植物乳杆菌C10与酒酒球菌VP41混合发酵时，不同接种时间对葡萄酒品质的影响。通过比较不同接种方式，评估该混合发酵对‘赤霞珠’葡萄酒理化成分和风味品质及感官的影响，以确定最佳的接种方式。

  2 材料与方法

  2.1 发酵菌株及培养

  所选的菌株有：商业乳酸菌O. oeni VP41（Lallemand, Inc., Montreal, BC, Canada）；植物乳杆菌L. plantarumC10；酵母菌D254。将生长对数期的植物乳杆菌和酒酒球菌，4000g离心10分钟得到菌体沉淀，接种至5%v/v的乙醇的改良驯化培养基。在28 ℃培养24h后，通过离心得到驯化细胞接种在葡萄酒中。驯化培养基的组成为：50 g/L MRS培养基；40 g/L D-果糖；20 g/L D-葡萄糖；1 g/L L-苹果酸；1 mL/L吐温80；6 % v/v 乙醇，模拟酒的pH调为4.6。

  2.2 苹果酸乳酸发酵实验

  本实验采用‘赤霞珠’葡萄汁进行发酵，该葡萄汁来源于中联长城桑干酒庄2024年采收的‘赤霞珠’葡萄果实，经筛选去除病虫害果、绿果及其他杂质，并进行除梗破碎处理后入罐获得。葡萄汁的基本理化指标如下：还原糖245.99 g/L，pH为3.67，L-苹果酸为5.55 g/L。本实验接种的酵母菌株为酿酒酵母D254，接种量为300 mg/L，乳酸菌有植物乳杆菌C10和酒酒球菌VP41，接种量为107 CFU/mL。接种方式按照酵母和乳酸菌的接种方式有同时接种（Simultaneous inoculation）和顺序接种（Sequential inoculation），共有四种接种方式：（1）Sim D254/C10；（2）Sim D254/(C10+VP41)；（3）Seq D254/C10；（4）Seq D254/(C10+VP41)。

  2.3 发酵过程中活菌数测定

  采用热培养基倾注法测定活菌数。取葡萄酒样品1 mL，用生理盐水稀释 10-9-10-1 CFU/mL 浓度梯度菌液后，混合均匀取1 mL稀释液加入培养皿中，倾注热MRS固体培养基并摇匀，待培养基冷却凝固后，放置恒温培养箱于37 ℃倒置培养48 h后计算菌落数。

  2.4 主发酵产物测定

  发酵液经0.22 μm水相滤膜（PES）过滤后，进行葡萄糖、果糖、甘油、乙醇及有机酸（柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸及乙酸）浓度的测定。使用安捷伦1200高效液相色谱仪，离子交换色谱柱为HPX-87H（Bio-Rad公司，美国）。流动相为5 mmol/L的硫酸，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。使用示差折光检测器（安捷伦，美国）测定葡萄糖、果糖、乙醇和甘油，色谱柱的温度为45 ℃，测定时间为30 min。有机酸的测定采用紫外检测器（安捷伦，美国），色谱柱的温度为60 ℃，测定时间为25 min。通过主发酵产物的出峰时间定性，根据主发酵产物标准品的标准曲线进行定量。

  2.5 数据统计与分析

  采用顶空固相微萃取结合气相色谱与质谱联用（HS-SPME-GC-MS）方法对葡萄酒中的高级醇类、酯类、脂肪酸类、萜烯及降异戊二烯类等挥发性香气物质进行测定。取5 mL葡萄酒样品、1.5 g氯化钠、10 μL 内标（4-甲基-2-戊醇，1.018 g/L）加入20 mL 样品瓶中，使用聚四氟乙烯瓶盖密封后准备上机。使用CTC CombiPAL自动进样器（CTC Analytics, Zwingen, Switzerland）完成HS-SPME前处理。酒样在40 ℃平衡 30 min后，在2 cm聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯（DVB/CAR/PDMS）SPME 萃取头（50/30 µm, Supelco, US）吸附30 min。

  使用Agilent 7890B-5975C（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）和HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 µm, J&W Scientific, CA, USA）进行GC-MS 分析。进样口温度为250 ℃，进样分流比为5:1，热解析8 min。载气为高纯氦气，其流速1 mL/min。色谱柱升温模式为：50℃保持1 min，3℃/min 升温至220℃保持5 min。质谱接口温度为250 ℃，电子轰击离子源（EI），离子能为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围为29-350 u。

  依据自动质谱图解卷积系统（AMDIS）计算保留指数（RI）及在NIST 11商业谱库中比对质谱图对化合物进行定性。利用 Masshunter 软件（MS 定量分析）积分峰面积，以各物质与对应内标的峰面积比为定量依据。

  2.6 颜色分析

  采用分光测色计（CM-3700A, Konica Minolta, Tokyo, Japan）对葡萄酒颜色进行测定。葡萄酒样品经0.45 μm聚醚砜膜（Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd, Tianjin, China）过滤后，在2 mm 比色皿中进行检测，记录L*值、a*值、b*值，空白对照为蒸馏水。

  2.7 数据统计与分析

  值表示为SD±平均值（n≥3），所有误差表示为每个处理一式三份的标准差（SD）。单因素方差分析与事后多重比较利用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，IL）完成。采用Duncan 检验（p < 0.05）来确定处理之间的显着差异，不同的字母表示统计学上的显着差异。使用GraphPad Prism 9处理折线图。使用ORIGIN绘制雷达图。PCA图由Simca绘制。

  3 结果与讨论

  3.1 微生物发酵动力学分析

  如图1所示，经过13天发酵，所有接种酵母的处理组在13天内均消耗尽还原糖。酒精发酵结束后葡萄酒酒精含量约为13.59 % v/v。除活菌数外，各发酵方式的葡萄汁的糖消耗、失重及酒精生成曲线均保持一致。在接种酵母菌24小时后接种乳酸菌，酵母菌数量保持增加至109 CFU/mL左右后，活菌数迅速降低至107 CFU/mL，第7天增加至108 CFU/mL，而后缓慢降低，直至发酵结束。与仅接种酵母的葡萄酒相比，乳酸菌的同时接入会影响酵母菌株的生长数量，却并不影响酵母消耗糖产生酒精的含量，这与前人的研究结果一致。这说明酒精发酵正常进行，不受乳酸菌接种的影响。

  在本研究中，同时接种酵母和乳酸菌的样品在12天完成发酵，顺序接种则需16天。酵母与乳酸菌共同接种最明显的优势是加快苹乳发酵速率，缩短整体发酵的时间。在葡萄汁中，乳酸菌的活菌数维持在107 CFU/mL，甚至达到108 CFU/mL。在酒精发酵之后接种乳酸菌，尽管初始接种量同样为107 CFU/mL，但活菌数呈现持续下降的趋势。这是由于发酵环境中的低营养物质和高酒精含量对接种的菌株产生胁迫。

  除了乳酸菌代谢L-苹果酸之外，酵母也可代谢L-苹果酸，在酒精发酵后的L-苹果酸仅剩2.663 g/L。酵母和乳酸菌同时接种时，L-苹果酸在接种前3天的消耗最快，其中VP41+C10混菌发酵的发酵速率快于C10。乳酸菌降解L-苹果酸速率的降低是由酒精含量逐步增加和营养成分减少导致的。对乳酸菌来说，逐渐适应酒精含量比直接接种在酒精环境中更加容易完成苹乳发酵。在酒精发酵结束后接入C10和VP41+C10，两种接种方式均在4天内完成苹乳发酵。本次结果表明植物乳杆菌能够在4天内快速消耗L-苹果酸。

  3.2 理化参数分析

  不同接种方式的‘赤霞珠’葡萄酒发酵结束后，葡萄酒的理化参数有显著变化。无论是同时接种还是顺序接种，各发酵方式葡萄酒的乙醇含量并无显著变化，这说明乳酸菌的接种不影响最终葡萄酒的乙醇的含量。与仅接种酵母D254的葡萄酒相比，苹乳发酵后葡萄酒的还原糖、琥珀酸、柠檬酸等营养物质呈现下降的趋势，特别是Seq D254/(C10+VP41)，进一步提高葡萄酒的微生物稳定性。同上一章研究结果一致，植物乳杆菌和酒酒球菌消耗己糖的代谢途径不同，在还原糖的代谢中或会产生协同作用。同时接种乳酸菌葡萄酒的乳酸物质含量显著高于顺序接种。这与植物乳杆菌代谢L-苹果酸的路径有关。植物乳杆菌能够通过苹果酸酶途径代谢L-苹果酸，代谢产物为丙酮酸，用于能量的产生。在降酸能力方面，Seq D254/(C10+VP41)的降酸能力更强，pH值较其他接种方式显著提高。

  在之前的研究中，常用酒酒球菌和酵母菌顺序接种，这是为了避免酒酒球菌利用糖生成过多的乙酸。而本次发酵结果表明，共同接种的葡萄酒产生的乙酸量低于顺序接种，并未出现共同接种产生过量乙酸的现象。这与前人的研究结果一致，接种较顺序接种的挥发性酸没有显著变化，相反，长时间的自然苹乳发酵会带来大量的乙酸。

  3.3 香气化合物分析

  使用HS-SPME-GC-MS在‘赤霞珠’葡萄酒中鉴定并定量共检出64种香气化合物，如表所示。将香气化合物进一步分类，分为6大类，包括15种高级醇、26种酯类物质、3种萜烯和降异戊二烯、5种脂肪酸、3种挥发性酚、4种其他物质。在本章苹乳发酵结束后的葡萄酒中，19种香气化合物OAV≥1，9种香气化合物0.1≤OAV<1。

  从PCA图（如图2）中可知，顺序接种与同时接种分布在第一主成分坐标轴的两侧，这说明两种苹乳发酵的接种方式有不同的香气轮廓。发酵时间长短并不会影响风味的释放，且各发酵方式的葡萄酒在酯类物质浓度存在显著差异。

 

 

  在酯类物质中，与其他发酵方式相比，Sim D254/(C10+VP41)的葡萄酒展现出更高的乙酸酯总量，其中乙酸异丁酯、乙酸异戊酯及乙酸己酯的含量在四种接种方式里均为最高。乙酸酯类物质大多贡献新鲜活泼的花果香，是新鲜型葡萄酒发酵香的主要来源。Sim D254/(C10+VP41)的葡萄酒的直链脂肪酸乙酯的含量显著高于顺序接种的葡萄酒，如己酸乙酯、反式3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯。在之前的研究中就有报道，植物乳杆菌与酵母同时接种的葡萄酒有更高的脂肪酸乙酯含量。Jiang等人认为，酵母和乳酸菌同时接种过程中脂肪酸乙酯的含量的增加，是由于酵母在脂质代谢过程中通过脂肪酸合成酶复合体生物合成脂肪酸，脂肪酸进一步积累促进脂肪酸乙酯的生成。但在本次研究中，并未观察到脂肪酸类物质的显著变化。酯类物质的动态变化与多种因素有关，无法用单一的成分变化解释酯类复杂的合成过程中动态变化，对于接种方式与乙酸酯物质的合成还需要进一步的深入探究。与高级醇乙酸酯的直接贡献新鲜果香不同，直链脂肪酸乙酯在浓度低于阌值时，可通过协同作用为干红葡萄酒贡献黑色/红色浆果香。不同脂肪酸乙酯的组成和比例是影响浆果香感知的关键因素，当直链脂肪酸乙酯的含量较高时可能会表现为红色浆果香。

  Sim D254/(C10+VP41)的乳酸乙酯和乳酸异戊酯含量最高，分别达到9096.80、39.18 μg/L，这或许是由苹乳发酵结束后生成的大量乳酸造成的。乳酸乙酯和乳酸异戊酯可以由乳酸和对应的醇类合成。在底物过量的条件下，反应动力学更加倾向酯类合成的途径。研究表明，乳酸乙酯会在苹乳发酵后大量积累，浓度范围在50-150 mg/L范围内。在本研究中，与顺序接种相比，同种乳酸菌与酵母菌同时接种时，葡萄酒中乳酸乙酯的含量增加。Lasik-Kurdyś等发现，乳酸乙酯的含量变化或与接种方式有关，酵母和乳酸菌同时发酵的葡萄酒中乳酸乙酯的含量更高。

  Seq D254/(C10+VP41)的其它酯含量增加，如辛酸异丁酯、乳酸异戊酯、癸酸甲酯、辛酸异戊酯、丁二酸二乙酯。这些物质大多含量不足达到阈值，因而对葡萄酒的感官有限。其中，苹乳发酵也会影响丁二酸二乙酯的物质含量。丁二酸二乙酯由丁二酸（微生物α-酮戊二酸代谢的副产物）被酯化生成，带有水果和甜瓜的香气。本研究中顺序接种的葡萄酒的丁二酸二乙酯的物质含量更高，这与其他研究结果相反。

  对于苹乳发酵的关键性物质——柠檬酸代谢产物如双乙酰、乙偶姻，混合接种产生的三种化合物含量均高于单菌发酵。在本次研究中还发现，顺序接种产生的三种物质含量也显著高于同时接种。这与早期的研究结果一致，同时发酵能够保留更多的果香，顺序接种则对应奶油等成熟的果香。这是由于同时接种导致的，与接种的细菌菌株无关，酵母消耗氧气导致还原条件，双乙酰因此被还原为乙偶姻和2,3-丁二醇，葡萄酒二乙酰含量低，2,3-丁二醇随二乙酰的降解而增加，从而影响葡萄酒的感官风味。

  葡萄酒中的花香是来源于萜烯类化合物。Devi和Anu-Appaiah等将植物乳杆菌和酒酒球菌接种在设拉子葡萄汁中共同发酵，发现共同发酵的葡萄酒含有更高浓度的萜烯类化合物。但本章研究结果中并未观察到不同发酵方式中萜烯类化合物的显著性差异。本章研究结果中大部分高级醇类也无显著性差异。

  乳酸菌可以代谢羟基肉桂酸生成挥发性酚，适量的挥发性酚能够给予葡萄酒香气的复杂性，过量的挥发性酚则对葡萄酒的香气产生负面影响。本次研究中苹乳发酵结束后均产生一定量的挥发性酚，均未超过其阈值。其中植物乳杆菌C10与酵母同时接种的葡萄酒的3-乙基酚含量为6.15 μg/L，显著高于顺序接种的乳酸菌的葡萄酒。

 

  3.3 颜色分析

  不同接种方式发酵后‘赤霞珠’葡萄酒的颜色参数如表3所示。同时接种的L*值显著高于顺序接种，a*和b*值均低于顺序接种，表现葡萄酒的酒体亮度更高，颜色更浅，红色色调更明显。

  3.3 感官特征分析

  从感官雷达图上来看，四种发酵方式整体风味轮廓相似，以红色浆果为主，新鲜果香其次（菠萝/相较、苹果/梨），以及甜香/糖渍水果/蜂蜜。其中同时接种的样品对应更高得分的红色浆果、甜香/糖渍水果/蜂蜜和整体香气强度，特别是Sim D254/（C10+VP41）。顺序接种的接种方式对应打分更高的偏成熟的风味，如奶酪/乳香、核果的风味。Seq D254/（C10+VP41）样品对应更高的柑橘/柠檬风味。

 

  3.8 结论

  本章探究植物乳杆菌C10及其与酒酒球菌VP41混合发酵在‘赤霞珠’葡萄酒的接种方式中发现，同时接种能够缩短葡萄酒整体发酵的时间，不影响酒精发酵的正常进行。

  混菌发酵的协同作用显著消耗葡萄酒中的还原糖，提高微生物稳定性。这种协同作用也表现在柠檬酸代谢产物如双乙酰、乙偶姻等物质含量的增加。

  在混菌发酵中，接种时间明显影响葡萄酒的风味。同时接种的葡萄酒含有更高的乙酸酯（乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯）、直链脂肪酸乙酯（己酸乙酯、反式3-己烯酸乙酯、辛酸乙酯），在感官上对应更高打分的红色浆果、甜香/糖渍水果/蜂蜜等风味。顺序接种的葡萄酒则含有更多的短链脂肪酸乙酯和柠檬酸代谢产物（双乙酰、乙偶姻），在感官上对应更高打分的偏成熟的奶酪/乳香、核果等风味。