制汁葡萄品种改良岗位

郭印山 林洪 姜长岳 赵玉辉

 

  植物激素是植物自身产生的、能转移至各部位调节植物生长发育的微量有机物质，人们通过模拟天然激素化学结构人工合成以及提取生物发酵产物等方法，生产出具内源植物激素类似生理活性或能影响内源激素合成、运输及代谢的外源活性物质，也就是现今生产实际中应用广泛，种类繁多的植物生长调节剂。随着消费者群体的关注点越来越趋于具有香气品质的葡萄，利用植物生长调节剂处理诱导葡萄香气组分的合成，提高商品性，作为生产中切实可行的优质栽培措施已日渐成熟。

  利用植物生长调节剂处理提高葡萄香气品质，符合现今消费市场需求，可切实提高产品经济效益。本试验对 ‘着色香’葡萄的花（果）穗进行不同种类及浓度组合的植物生长调节剂处理。果实香气组分含量及种类的变化，筛选适宜具体品种的葡萄优质栽培的植物生长调节剂处理方法。并对挥发性香气物质合成途径关键基因做靶向转录表达分析，以丰富植物生长调节剂处理下葡萄香气化合物合成代谢的响应机理研究，为生产实践提供理论基础。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  以7年生‘着色香’葡萄为试材，试材取自沈阳农业大学葡萄实验基地日光温室，篱架式栽培“Ｔ”形整形，南北行向，株行距0.5 m×1.8 m，行间覆盖黑色地膜，席间配备滴灌装置，对试材进行统一修剪及肥水病虫害防治常规管理。供试药剂见表1。

 

 

  选择树势中庸，生长势基本一致，无病虫害的植株作为试验母株，选取树体上长势中庸、叶片数量相近，果枝粗壮程度基本一致的结果母结，每枝留１个大小相近的花穗为实验对象，于适宜时期分别用不同浓度的复配植物生长调节剂浸蘸花穗10s，一并实施疏粒，套袋等措施。两品种各设不同试验处理，以清水处理为对照，采用单株小区， 随机区组排列。

  1.2 试验处理

 

 

  ‘着色香’葡萄花芽分化能力较强，于花前及早摘除多余花序减少树体营养损耗。第一次处理在花前5-10天（2021年4月15日至20日）进行，以50-100 mg•L-1 GA3为主，复配低浓度CPPU及PCPA，可大幅提高果实无核率。第二次处理于第一次处理后2周（2021年5月1日至5日）进行，以50-100 mg•L-1 GA3为主，具拉长果穗膨大果粒的效果，具体见表2。两品种各设7个实验处理，以清水处理为对照，采用单株小区， 随机区组排列，重复3次。

  1.3 葡萄香气物质的测定

  根据果实种子木质化及褐变程度，可溶性固形物含量以及口感判断果实成熟度，取各处理及对照成熟期葡萄果实，放入冰盒带回实验室，用液氮速冻，并放在-80 ℃超低温冰箱保存以待测定。

  葡萄香气物质的测定：参照孙婷（2019）的试验方法，采用顶空固相微萃取结合气相-质谱联用仪（美国 Agilent 公司 5975C-7890A GC-MS) 进行果实挥发性香气物质的定性分析及定量检测。取出-80 超低温冰箱备用的果实，洗净，去除果梗和种子，用液氮在遇冷的研钵中将果皮果肉研磨至匀浆，将匀浆倒入10ml离心管中后放入离心机，8000 r/min离心10 min。抽取8ml上清液打入20ml顶空萃取瓶中，并放入3 g NaCl以及一个磁力转子，用微量进样器将1.5μL内标物质（稀释500倍的3-辛醇）打入顶空瓶后快速封盖，将顶空瓶放在恒温磁力搅拌器上加热，预热10 min后将 SPME 萃取头插入到样品顶空瓶中，伸出石英纤维在距离液面 1-2 cm 处进行萃取。磁力转子转速设为 950 r•min-1，在60℃下吸附40 min，过程中保证样品切勿沸腾。吸附完成后把石英纤维抽回，缓慢抽出萃取头，直接插入气相色谱的进样口，于250 ℃解析 5 min。

  具体参数设置及运行程序如表3、表4所示。

 

  1.4 葡萄香气物质的定性及定量

  将质谱端采集到的挥发性物质与 NIST11 标准谱库中进行比对检索，得出各组分的匹配检索化合物CAS序号，出峰时间，峰面积以及匹配度等信息，从而确定香气成分。采用峰面积归一法计算相对含量，利用固定浓度内标物质3-辛醇峰面积进行各个样品中香气物质进行绝对含量的计算，计算方法为：

  1.5 葡萄果实香气合成途径酶基因实时定量PCR分析（qPCR）

  1.5.1 总RNA的提取

  提取‘着色香’葡萄Y6处理、Z4处理及各自对照果实青果期，转色前，转色期，成熟期样品的总RNA ，具体方法参照马娜（2019）并略做改动。

  1.5.2 总RNA的香气合成途径基因的反转录及定量PCR

  采用Vazyme HiScriptⅡRT SuperMix for qPCR反转录试剂盒以四个时期两品种的处理组及对照组样品的总RNA为模板反转录合成cDNA。反转录分为两步，（1）DNA 消除的反应，体系如表6所示，将所有试剂加入200μL离心管中做好标记混均匀离心，PCR仪程序设置为42℃ 2min，4℃保存。

  （2）DNA 消除反应结束后，马上取出第一步反应后离心管分别加入如表7的反应体系。然后再将样品充分混匀离心，然后放在PCR仪中，设置并运行程序50℃ 15min，85℃ 5sec，4℃保存。程序完成即为各样品的cDNA。

  香气合成途径基因的相对表达量使用康为世纪的qPCR试剂盒MagicSYBR Mixture qPCR进行测定，以GAPDH作为内参基因，定量PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列具体见表9。按表8中的qPCR反应体系进行试验。qPCR反应程序设置并运行为：95℃预变性30sec，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，，共计40个循环。反应结束后，采用 2-△△Ct的方法进行计算实时荧光定量反应中基因的相对表达量。

 

 

  2 结果与分析

  2.1 不同处理下‘着色香’果实挥发性香气物质的正交偏最小二乘判别分析

  为了研究处理‘着色香’葡萄处理组与对照果实香气的变化，以样品中所有被检测到的的香气组分及含量作为因变量，以不同处理为自变量做正交偏最小二乘判别分析，

  如图1A所示，红色圈起的部分为各处理样品，蓝色圈起的部分为对照，可以看出处理组及对照实现了有效的分离，说明‘着色香’在处理与否的两组样品之间香气构成存在差异。经过200次置换检验 (Permutation test)，如图1B，Q2回归线与纵轴的相交点小于零，说明模型不存在过拟合，模型验证有效。

 

  前人研究通过计算OAV值来评价某种香气对葡萄整体香气的贡献度，OAV值>1时认为该香气物质对葡萄香气具有一定影响性，OAV值越大认为该组分对果实整体香气贡献越大。通过OPLS-DA分析，可以根据VIP值＞1归纳出16种差异香气组分，用各物质的香气阈值计算OAV值，具体见表9。从中筛选出几种OVA值较大的物质，两种具果香味的酯类物质乙酸乙酯，丁酸乙酯，处理后均较对照明显增加，两种具花香味的萜醇类物质芳樟醇，香叶醇，处理后均较对照明显下降。一种具清新草本香气的醛类物质正己醛，各处理与对照相比均下降。

 

  2.2 植物生长调节剂对‘着色香’葡萄果实香气相关基因表达的影响

  通过对不同激素处理下的葡萄果实进行品质指标的评定，Z4处理下的果实在无核率，单果重及糖酸含量、果实硬度等方面品质突出，果实香气方面Z4处理的被检出物质种类在所有处理中最多，香气总含量相对较高仅次于Z3处理，且差异不显著。Z4处理香气总含量与CK相比虽然有所下降，但被检测到的挥发性物质种类增加，且各类组分含量及占均有较大变化，Z4处理异戊二烯途径下的萜类产物总含量较对照明显减少，而脂肪酸代谢途径下的酯、醛、羧酸类等香气物质总含量明显提高，该途径下产物种类较对照增加4种。为了探明激素处理后“着色香”葡萄香气物质合成酶基因水平的调控变化，分别对‘着色香’葡萄CK及Z4处理果实发育的四个时期（同上）的果样进行异戊二烯代谢途径酶基因的表达量分析。

  通过对不同激素处理下的葡萄果实进行品质指标的评定，Z4处理下的果实在无核率，单果重及糖酸含量、果实硬度等方面品质突出，果实香气方面Z4处理的被检出物质种类在所有处理中最多，香气总含量相对较高仅次于Z3处理，且差异不显著。Z4处理香气总含量与CK相比虽然有所下降，但被检测到的挥发性物质种类增加，且各类组分含量及占均有较大变化，Z4处理异戊二烯途径下的萜类产物总含量较对照明显减少，而脂肪酸代谢途径下的酯、醛、羧酸类等香气物质总含量明显提高，该途径下产物种类较对照增加4种。为了探明激素处理后“着色香”葡萄香气物质合成酶基因水平的调控变化，分别对‘着色香’葡萄CK及Z4处理果实发育的四个时期（同上）的果样进行异戊二烯代谢途径酶基因的表达量分析。

  葡萄中单萜类化合物合成的初始底物是C5单位异戊基焦磷酸盐及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸盐，1-脱氧木酮酸-5-磷酸酯合成酶（DXS）是该类底物生物合成的一级限制酶，这些底物通过香叶酰二磷酸合成酶（GPPS）转化为GPP。萜烯合酶（TPS）随后负责催化GPP形成单萜。DXS1基因为萜类物质代谢MEP途径前期合成酶基因，如图7所示，在处理及对照果实发育前期其表达量逐渐上升，转色期达到峰值后成熟期趋于下降，各时期对照DXS1表达量均高于处理，且s3，s4时期差异显著，GPPS基因为MEP途径中期合成酶基因，在处理及对照中表达量表现为不同的变化趋势，对照中GPPS基因随果实发育呈逐渐上升趋势，成熟期表达量达到最高，而GPPS基因在Z4处理青果期表达量开始升高，转色前期增至最大值且表达量高于对照，然后于转色期，成熟期逐渐降低，果实成熟期对照高于处理，差异显著，这与CK中芳樟醇，香叶醇等萜类化合物含量高于Z4处理相吻合，‘着色香’葡萄TPS10基因的变化走势与‘阳光玫瑰’类似，s1，s2，s3表达水平低下，成熟期表达量明显增高，并升至最大值，各时期Z4处理TPS10均较CK不同程度下降，在s2，s3发育阶段差异显著，成熟期表达水平无显著差异。

  对‘着色香’葡萄CK及Z4处理果实进行脂肪酸代谢途径酶基因的表达量分析，取样时期及样本同上，LOX1及HPL1基因为脂氧合酶途径中催化不饱和脂肪烃类转化生成C6、C9醛类物质的关键酶基因，如图3所示，两基因在‘着色香’果实发育前期表达量较高，随后逐渐下调，s1，s2时期LOX1基因在对照中表达量显著高于Z4处理，这与药剂处理后正己醛含量较对照显著下降相吻合，AAT1基因为果实发育后期醛醇类物质转化合成酯类过程中的关键酶基因，青果期未在样本中检测到其发生转录表达，随果实逐渐发育成熟表达量升高，于s4时期达到峰值，各时期Z4处理AAT1表达量均高于对照，成熟期差异显著，这与Z4处理中乙酸乙酯，丁酸乙酯等酯类化合物含量高于对照相吻合。

  3 小结

  在本试验中，植物生长调节剂处理后‘着色香’香气组分含量及构成发生明显变化。具体结果如下：

  1、处理后‘着色香’转色期及成熟期的果实中DXS1及GPPS表达水平显著降低，TPS10基因表达量也在转色前及转色期较对照明显下降，并与激素处理后果实萜类物质含量下降变化趋势一致。

  2、处理的‘着色香’青果期及转色前果实中LOX1基因下调表达，HPL1基因变化趋势相反，较对照表达量显著提高，AAT1基因在能被检测到的三个时期处理果实的转录水平均较对照有不同程度上调，成熟期出现峰值，处理显著高于对照。

  3、‘着色香’中正己醛，2-己烯醛等醛类含量在处理后明显下降，正己醇，顺-2-已烯-1-醇等较对照含量不同程度增加，推测CPPU促进了脂肪族产物从醛向醇的转变。