鲜食葡萄品种改良岗位

  一、引言

  葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上栽培历史最长、产量最大的水果之一，主要分为鲜食葡萄和酿酒葡萄。中国葡萄栽培以鲜食葡萄为主，香气物质所产生的果实香味对消费者的喜爱程度具有重要影响，是评价果实品质的重要指标。目前人们对鲜食葡萄品质的关注度越来越高，因此，探讨鲜食葡萄香气品质对于改善果实香味，以及提高消费者喜好度和市场接受度具有重要意义。

  葡萄果实萜类化合物中含量最丰富的是单萜（monoterpene），以具有挥发性能直接贡献香气的游离态和对果实香气没有直接贡献，需要通过酶解或酸解转化成游离态组分才能增加果实的香气特性的糖苷结合态两种形式存在，常被用作葡萄果实及葡萄酒品种鉴别的特征化合物。香气可以通过前鼻嗅香气感知和后鼻嗅感知两种途径到达嗅觉上皮细胞。后鼻嗅香气的感知与香气物质在口腔中的释放过程密切相关，有研究表明，唾液的pH值、酶活力、咀嚼方式、口腔温度等条件都会影响香气物质的后鼻嗅感知结果。不同受试者在咀嚼食物时的咀嚼时长、咬合幅度以及咀嚼方式等存在差异，当咬合幅度较小以及咀嚼时间较长时更有利于后鼻嗅香气的释放。对于气味阈值来说，相同的气味组分在前鼻嗅感知途径中的气味阈值会高于在后鼻嗅感知途径中的气味阈值。

  本研究采用气相色谱质谱联用技术比较同一杂交群体不同品系葡萄的单萜类组分差异，并探讨鲜食葡萄在口腔中所释放的“玫瑰香味”主要由何种形式的萜类组分贡献。利用定量描述性分析方法对鲜食葡萄的“玫瑰香味”程度进行定量，通过3-AFC法对关键呈香组分在水溶液中的鼻后阈值进行测定，并探究利用数学建模的方式构建“玫瑰香味”与萜类组分间的预测模型，以实现通过呈香组分科学预测“玫瑰香味”的强度。结合Stevens定律探究香叶醇、香茅醇、橙花醇和里那醇等玫瑰香化合物的Stevens系数以及化合物在不同浓度下的香味强度。本研究为葡萄育种者选育优质、高喜好度的“玫瑰香味”鲜食葡萄品种提供科学依据，为鲜食葡萄的风味化学研究提供数据支撑。

  二、材料与方法

  根据实验室前期研究（未发表）选择‘爱神玫瑰’和‘瑞都红玫’两个萜类含量丰富的葡萄果汁作为材料与唾液进行混合。对照组：15 mL样品瓶内先加入1.00 g氯化钠，然后分别加入澄清唾液和葡萄果汁共5 mL（V唾液：V果汁=1：5），加入10 μL内标物质（4-甲基-2-戊醇，1.0388 g/L）。实验组：15 mL样品瓶内先加入澄清唾液和葡萄果汁共5 mL（V唾液：V果汁=1：5），待唾液与果汁相互作用6秒后，加入1.00 g氯化钠和10 μL内标物质（4-甲基-2-戊醇，1.0388 g/L）。对样品进行GC-MS分析，每个样品重复测定3次。

  在这项研究中，选择14种具有不同程度‘玫瑰香味’的葡萄果汁作为材料。其中mixA表示由R23和R62混合，mixB表示由R9和R149混合，mixC表示由R54、R81、R87混合。这些葡萄是玫瑰香型鲜食葡萄'Italia'和'Tamina'（V. vinifera L.）的F1杂交种，种植在北京林业和农业科学院林业与果树研究所葡萄园（中国北京，北纬39°58′，东经116°13′）的避雨棚下，行距2.5米，株距0.75米。 在2019年按照E-L系统的物候期在（E-L38）采集样品，从植株上的肩部、中部和顶部位置的葡萄串中随机采集50个无损伤、无病虫害的浆果。然后，部分浆果立即用于感官分析和标准的物理化学分析，其余的浆果被冷冻在液氮中，储存在-80℃，用于随后的挥发性化合物分析。

  基于HS-SPME-GC-Quadrupole-MS技术对14个葡萄果汁样品中的萜类物质进行定性和定量。样品瓶被移至加热搅拌器装置中，在40℃条件下加热搅拌30 min，搅拌速度为500 rpm。将活化后的SPME萃取头插入样品瓶的顶空部分，在40℃条件下继续加热搅拌30 min，取出SPME萃取头后，立即插入GC进样口在250℃条件下解析8 min。对挥发性化合物进行提取。参考实验室已有的方法（Liu et al., 2018; Wang et al., 2018）设定气相色谱质谱联用仪的条件，分离挥发性化合物。

  “玫瑰香味”在鲜食葡萄中通过后鼻嗅感知，因此在本研究中对于“玫瑰香味”参比标度的建立以及鼻后阈值的测定均采用后鼻嗅感官品评的方式。后鼻嗅感官品评方法参考Zhao等人的研究（2018）稍加修改（图1）。参考Atanasova等人（2004）关于建立正丁醇参比标度的研究以及De-La-Fuente-Blanco等人（2020）的相关研究，稍加修改后建立参比标度（图1），各强度对应的参比样溶液具体浓度见附表2。选择10名评价员进行培训，组成优选评价员感官评价小组。感官评价小组使用本研究建立的“玫瑰香味”参比标度对果汁样品的“玫瑰香味”进行评价，使用国家标准 GB/T 29604-2013 中关于“甜味”强度和“酸味”强度的单一溶液参比样对果汁样进行评价。

将待测强度的14个葡萄果汁样品，每个取10 mL装入带盖品评杯中，使用三位随机数字对样品进行编码,以随机顺序呈递给优选评价员，依次品尝果汁样品，并使用参比标度（0 ~ 15 cm）对葡萄果汁不同的感官属性强度进行评定，品尝不同样品时需要漱口并休息，实验重复测定2次。

  使用GraphPad Prism 9.0.0绘制小提琴图、感官属性得分图；使用PanelCheck 1.4.2进行感官小组能力检验；使用SigmaPlot 14.0绘制S曲线拟合图；使用R 3.6.3绘制气泡图，进行逐步回归分析（Stepwise regression）和单因素方差分析；SIMCA 14.1（Umetrics, Umea, Sweden）进行主成分分析（PCA）、通过MetaboAnalyst 5.0（http://www.metaboanalyst.ca/）绘制聚类热图、采用XLSTAT 2019进行偏最小二乘回归分析（PLSR）。

  三、结果与讨论

  3.1 唾液对葡萄汁中单萜含量的影响

  选择具用有强烈“玫瑰香味”的‘爱神玫瑰’和‘瑞都红玫’两种葡萄果汁探究鲜食葡萄在口腔加工过程中是否存在糖苷结合态物质经过唾液α-淀粉酶水解。在两种果汁样品中共检测到22种萜类化合物，包括 β-月桂烯、D-柠檬烯、β-trans-罗勒烯、γ-松油烯、β-cis-罗勒烯、cis-氧化玫瑰、trans-氧化玫瑰、(E,Z)-Allo-罗勒烯、Allo-罗勒烯、cis-呋喃型氧化里那醇、橙花醚、里那醇、4-松油醇、脱氢里那醇、薄荷醇、α-松油醇、香叶醛、吡喃型氧化里那醇、香茅醇、橙花醇、香叶醇和香叶酸。其中薄荷醇在‘瑞都红玫’中未检测到，橙花醚在‘爱神玫瑰’中未检测到。

  与对照组相比，22种萜类化合物的含量均表现出无显著差异，且萜类化合物在对照组与实验组中的分布情况相似（图2），说明葡萄果汁经唾液作用后，并无糖苷结合态的物质经唾液α-淀粉酶水解。由此推测，鲜食葡萄在口腔中感知到的“玫瑰香味”主要由游离态萜类物质贡献，而非糖苷结合态萜类物质。

  3.2 单萜的定性与定量

  为探究意大利×塔米娜杂交F1代品系中不同样本中游离态萜类物质含量的差异，对14个具有不同程度“玫瑰香味”的葡萄果汁中的游离态萜类物质进行测定。共鉴定出26种萜类化合物，不同样本中的单萜化合物总量不同，其中，R189的单萜总量最高，R192的单萜总量最低。

  26种萜类化合物被分为3组（图3A），第一组为trans-呋喃型氧化里那醇、脱氢里那醇、里那醇、cis-呋喃型氧化里那醇、吡喃型氧化里那醇，均为里那醇及其衍生物；第二组为橙花醇、香叶酸、香茅醇、橙花醚、cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰，均为香叶醇衍生物；第三组为香叶醇、橙花醛、香叶醛、D-柠檬烯、4-松油醇、异松油烯、α-松油醇、β-cis-罗勒烯、β-trans-罗勒烯、(E,Z)-别罗勒、β-月桂烯、别罗勒烯、β-水芹烯、α-松油烯和γ-松油烯，包括香叶醇及其衍生物及环状、链状单萜。

  14个样品被分成4组（图3A），R159和R118为Group 1；R189为Group 2；R113和R31为Group 3；R28、R55、R75、R156、R157、R192、mixA、mixB、mixC为Group 4。Group 1中的香叶醇及其衍生物、链状单萜及环状单萜含量较高，而里那醇及其衍生物含量较低；Group 2的萜类物质含量整体都高于其他样本，仅有少部分萜类化合物，如cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰，显著低于其他样本；Group 3的里那醇及其衍生物，以及橙花醚、cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰等香叶醇衍生物含量较高；Group 4均表现出较低的萜类化合物含量。基于游离态萜类物质测定结果，发现同一杂交群体不同品系葡萄具有不同的单萜分布情况。

  3.3 感官分析

  为评估感官评价小组的一致性以及每位评价员对样品的区分能力和重复性，本研究采用PanelCheck软件对10位评价员的感官描述性分析（QDA）结果进行分析。Turkey-1分析图中的圆点代表每位评价员，圆点间的聚拢程度代表评价小组的一致性，即圆点之间距离越接近，代表评价小组间一致性水平越高。F值可以用来展示评价员区分样品的能力，即组间差异与组内差异的比值，F值越大表示评价员对相关属性的区分能力就越好。MSE值可以用来展示评价员评估样品的重复性，即组内方差，当MSE值越低时说明单个评价员的重复性越好。根据分析结果可知，评价小组在后鼻嗅“玫瑰香味”、“甜味”和“酸味”等属性上的一致性较好，对样品具有较好的区分能力并且具有较好的重复性。

  采用QDA对14个果汁样品的后鼻嗅“玫瑰香味”、“甜味”和“酸味”进行评价。计算每个样品在各个属性上的得分，并绘制感官属性得分图（图3B）。

  14个果汁样品在三个感官属性上均具有显著性差异。在后鼻嗅“玫瑰香味”属性上的强度范围在7.08 ~ 11.39分，其中，R31的“玫瑰香味”强度显著高于其他样品，而R192的“玫瑰香味”显著低于其他样品；在“甜味”属性上，14个葡萄果汁的“甜味”强度范围在6.10 ~ 10.32分，其中，mixC的“甜味”显著高于其他样品，而R192的“甜味”显著低于其他样品；在“酸味”属性强度方面，14个葡萄果汁的“酸味”强度范围在2.20 ~ 6.95分，其中，R192的“酸味”显著高于其他样品，而mixC的“酸味”显著低于其他样品。根据分析结果可以发现，同一杂交群体中的14个葡萄果汁中，R31表现出强烈的“玫瑰香味”，R192具有最强烈的“酸味”，但“玫瑰香味”与“甜味”强度均为最低，mixC的“甜味”最强但是“酸味”最弱。

  3.3 后鼻嗅阈值和香气贡献分析

  为评估单萜化合物在样品中的风味贡献，测定了香叶醇、香茅醇和橙花醇等关键玫瑰香化合物在水溶液中的鼻后阈值，又称风味阈值（Flavor threshold value，FTV）。为了提高计算结果的准确性对得到的数据结使用S曲线进行拟合，得出香叶醇（图4A）、香茅醇（图4B）以及橙花醇（图4C）等化合物在水溶液中的鼻后阈值，分别为4.5 μg/L，5.4 μg/L和35.9 μg/L。Plotto等人（2004）发现，香气化合物的鼻前阈值（Odor threshold value，OTV）通常高于鼻后阈值，在本研究中，香叶醇、香茅醇和橙花醇三个化合物在水溶液中的鼻前阈值分别为40 μg/L、40 μg/L和300 μg/L（Fenoll et al., 2009），均高于鼻后阈值，与报道的结论一致。

  其他单萜化合物在水溶液中的鼻后阈值已有前人进行了测定。如Buettner等人（2001）测定出(R)-柠檬烯在水溶液中的鼻后阈值为34 μg/L。Ahmed等人（1978）测定出α-蒎烯在水溶液中的鼻后阈值为1014 μg/L，月桂烯为42 μg/L，柠檬烯为210 μg/L，α-松油醇为300 μg/L，里那醇为3.8 μg/L，柠檬醛（同分异构体混合物）为41.4 μg/L。本实验的研究结果可为单萜化合物在水溶液中的鼻后阈值提供补充。

  （Odor activity value）气味活度值（OAV）是指香气物质的浓度与其鼻前阈值的比值，（Dose over threshold）剂量比阈因子（DoT）是指香气物质的浓度与其风味阈值的比值（Wang et al., 2021a）。通过计算26种单萜化合物在所有样品中的OAV值和DoT因子，来评估单萜化合物在样品中的香气活性和风味贡献。(E,Z)-Allo-Ocimene、Allo-Ocimene、Linalool oxide pyranoside三种化合物因没有查到鼻前阈值而无法计算OAV值；除β-Myrcene、D-Limonene、Linalool、Neral、α-Terpineol、Geranial、Citronellol、Nerol、Geraniol等9种化合物外其他化合物因无法查到鼻后阈值而无法计算DoT因子。

  分析OAV值结果可得，里那醇具有较高的OAV值，在R113样品中的OAV值最高为1111.28，在R189、R31、mixB、R55、mixC的OAV值也较高都大于500。cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰在样品中也表现出较高的OAV值。cis-氧化玫瑰在R31、R113和R118三个样品中的OAV值最高都大于200，在R75、R157、mixB、mixC、R189、R156、R159的OAV值也较高都大于100。trans-氧化玫瑰在R31、R113和R118三个样品中的OAV值最高都大于100（图4D）。

  分析DoT因子结果可得，里那醇和香叶醇在样品中均表现出较高的DoT因子。里那醇在R113、R189和R31三个样品中的DoT因子最高，均大于1000。其次，在mixB、R55、mixC、R159和R118五个样品中的DoT因子也较高，均大于500。香叶醇在R118、R159和R189三个样品中的DoT因子最高，均大于200（图4E）。根据分析结果发现，里那醇、cis-氧化玫瑰、trans-氧化玫瑰和香叶醇是贡献鲜食葡萄风味的重要化合物。

  3.4 玫瑰香味浓度与强度相关性分析

  为探究玫瑰香化合物的Stevens系数，利用玫瑰香参比标度对香叶醇、香茅醇、橙花醇和里那醇等玫瑰香化合物在不同浓度下的香味强度进行测定。以目标化合物浓度的自然对数为x轴，以化合物香味强度的自然对数为y轴，绘制ln浓度-ln强度关系图（图5A），以化合物DoT因子为x轴，香味强度值为y轴，绘制化合物DoT因子-强度关系图（图5B），来探究玫瑰香化合物中浓度或DoT因子与香味强度的关系。

  根据分析结果发现香叶醇的Stevens系数为0.2577，与Patte等人（1975）报道的香叶醇标准Stevens系数0.26相接近，香茅醇的Stevens系数为0.4581，橙花醇的Stevens系数为0.4029，里那醇的Stevens系数为0.1676。对比四个化合物的结果可得，玫瑰香化合物在同一浓度水平下呈现出的“玫瑰香味”强度不同，四个化合物的Stevens系数由高到低表现为香茅醇＞橙花醇＞香叶醇＞里那醇。香茅醇的香味感知随浓度变化最敏感，而里那醇的香味感知随浓度变化最不敏感。该结果量化了香叶醇、香茅醇、橙花醇和里那醇对“玫瑰香味”的贡献。

  4. 结论

  在这项研究中获得了大量与鲜食葡萄中“玫瑰香味”相关的数据。我们的研究结果表明口腔中感知到的后鼻嗅“玫瑰香味”主要由游离态萜类组分贡献，而非糖苷结合态组分。通过游离态单萜化合物浓度分析结果发现，同一杂交群体不同品系葡萄具有不同的单萜分布情况。建立了适用于评价后鼻嗅“玫瑰香味”的参比标度，对14个葡萄果汁进行定量描述性分析，发现“玫瑰香味”较强的葡萄果汁通常具有较弱的“酸味”和较强的“甜味”。该参比标度可用于科学定量鲜食葡萄“玫瑰香味”强度的相关研究，并为建立其他特殊香味参比标度的研究提供了参考。通过3-AFC法测定了三个重要化合物在水溶液中的鼻后阈值为单萜化合物在水溶液中的鼻后阈值提供了补充。我们的研究结果量化了四种玫瑰香化合物对后鼻嗅“玫瑰香味”的贡献，结果表明香茅醇的香味强度随浓度变化敏感度最高，里那醇的敏感度最低，其中里那醇对后鼻嗅“玫瑰香味”的贡献取决于葡萄样品中萜类组分的浓度水平，在萜类组分浓度较高时可与“玫瑰香味”表现出较强的正相关作用。在这里我们对萜类组分的浓度值和“玫瑰香味”强度进行建模得到预测“玫瑰香味”强度的最优模型。本研究的结果为葡萄育种者选育优质“玫瑰香味”鲜食葡萄品种、改进葡萄风味提供了依据。