育种方法与技术岗位

  葡萄基因稳定转化需较长时间，且转化效率低，利用瞬时转化来研究葡萄基因功能是目前葡萄基因功能验证常用的实验技术，对该技术方法的整理和总结对葡萄功能基因鉴定和转基因育种具有重要意义。实验室葡萄叶片瞬时转化基因表达实验可采用以下技术方法。

  1、材料选择与药品。可选择葡萄幼嫩叶片或组培苗叶片作为实验材料，通常使用无核白、霞多丽、玫瑰香等品种开展实验处理的步骤基本相同。实验中主要用的药品包括硫酸卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮、乙磺酸、氯化镁、LB培养基等。

  2、实验步骤。

  （1）瞬时转化使用根癌农杆菌进行侵染。首先活化、收集农杆菌。将构建好的基因瞬时转化载体通过化学转化法转入EHA105农杆菌菌株，并涂板于50mg·L-1 Kan，50 mg L-1 Stre的LB固体培养基中。挑取单克隆用含有相同抗生素的LB液体培养基摇菌保存。

  （2）将保存的农杆菌活化后转入LB抗性液体培养基中，28℃，220 rpm过夜培养。第二天将菌液倒入50ml离心管中，6000 rpm，离心8 min，弃上清。用悬浮液（1M MES，1M MgCl2，100m MAS）重悬菌体，摇菌至 OD600为0.6-0.8。将重悬好的菌液于室温下，黑暗放置2-3 h。

  （3）由于葡萄叶片的蜡质层较厚，所以葡萄叶片的瞬时表达采用真空渗透的方法，将幼嫩的葡萄叶片置于玻璃培养皿中，将重悬好的农杆菌菌液浸没葡萄叶片，然后将培养皿置于真空箱内，-0.1 Mpa，真空渗透30 min（不同品种葡萄叶片有差异，可选择20 min重复1-2次真空渗透）。

  （4）将农杆菌真空渗透侵染的葡萄叶片置于室温下共培养2天，进行取样并开展后续实验。

  （5）载体携带GUS报告具有，可通过GUS染色的方式判断瞬时转化成功。将转化叶片用含有底物的缓冲液浸泡，若转化成功在适宜的条件下可将 X-Gluc水解生成蓝色产物，使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可观察，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性强弱。