济南综合试验站

刘利 李勃

 

  土壤盐碱化是一个日益严重化的全球性问题，是一种普遍存在的非生物胁迫。盐碱地是盐土和碱土的总称，盐土是PH不一定很高但氯化物或硫酸盐含量较高的碱性土壤，碱土是PH较高且含有较高的碳酸盐或重磷酸盐的碱性土壤。我国共有17个省份拥有较多的盐碱地，主要分布在西北、东北、华北地区，总面积超过3300万hm2，占世界耕地面积的7.7%，盐碱化程度较高的土地大多数植物不能生存。滨海盐碱土主要分布在江苏、山东、河北等地，山东省拥有国内较大的盐碱耕地面积，共有盐碱地近60万hm2，可利用的盐碱耕地大约为39万hm2，主要分布在东营、滨州、潍坊和德州4地。盐碱对植物的危害主要造成植物体内的生理干旱和组织的损害，以及影响营养物质的吸收和叶片气孔开闭等方面。

  葡萄是重要的特色经济作物，是对盐中度敏感的非盐生植物，最适pH在5.8～7.5，能够正常生长的土壤盐量在0.14%～0.3%。盐碱化是国内外葡萄栽培研究中日益关注的问题，例如国外的澳大利亚、希腊、意大利、印度、伊朗、西班牙、土耳其和美国的某些地区和国内的大量研究，我国葡萄栽培区的土壤部分为盐碱土，盐碱胁迫影响着葡萄生长发育，果实产量和品质，制约葡萄产业的发展。盐碱胁迫严重限制了葡萄的生长和产量。在自然界中，高盐和高pH两种作用往往会同时出现共同作用于植物，其对植物的伤害作用比单独的盐或碱伤害更大。目前大多数的研究都是利用NaCl作为盐度源来研究，而很少研究NaCl+NaHCO3作为盐度源，并且主要是盐碱胁迫对光合、渗透胁迫等相关指标影响的探究。氮素是葡萄需求量最大的元素之一，是葡萄生长的主要限制因素，对提高葡萄生产力，增加产量有重要意义。目前，关于盐碱胁迫在果树上已有报道，葡萄领域的研究多集中在复合盐碱处理对葡萄砧木的表型、新梢生长量、叶片和根系中丙二醛含量、叶绿素形态结构、含量和叶绿体荧光参数等生理指标，对于葡萄在盐碱胁迫下对氮素的吸收利用的相关研究鲜有报道。为此，本研究以3309M嫁接的‘阳光玫瑰’为试材，研究葡萄幼苗在盐碱胁迫下对根系及叶片指标、钠钾离子含量、氮同化关键酶活性、氮素利用率等指标，为葡萄在盐碱下的生长和氮的吸收利用提供一定的理论支持。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  试验于2023年3—6月在山东省农业科学院通风的温室大棚中进行，供试材品种为‘阳光玫瑰’，嫁接砧木为3309M (Vitis vinifera L.)，种植于黑色塑料花盆中（高23 cm，直径21.5 cm），基质为珍珠岩和蛭石比例为1∶1混合物，每盆定植一株两年生幼苗。每隔一天浇水一次，在幼苗长到4～5片真叶时选择长势一致的18株，每周施一次营养液。第一周施加1/8 Hoagland营养液培养，第二周施加1/4 Hoagland培养，第三周及后期施加全Hoagland培养。

  1.2 试验方法

  1.2.1 试验设计

  试验共设计两个处理，对照组（不添加盐碱）、盐碱胁迫（添加比例为1∶1的0.2 mol·L-1 NaCl溶液和0.2 mol·L-1 NaHCO3溶液），每个处理重复3次，每个测量重复3次。每个处理选取3株长势一致的植株，用K15NO3（购自上海化工研究院有限公司）进行同位素标记处理用于后期15N利用率的测定。叶绿素仪测定叶绿素含量，测定生物量、根系指标、氮含量、Na+、K+含量。取剩余样品于液氮冷冻，置于﹣80 ℃冰箱中用于酶活等指标测定。

  1.2.2 指标测定

  将葡萄幼苗小心从基质中拔出，洗净擦干后，分成叶片、茎、主干及根部四部分，剪碎后放入信封，用千分之一天平称量四部分的鲜质量，分别于105 ℃杀青40 min，80 ℃烘至恒重，作为叶片、茎、主干及根部的干质量。用EPSON Scan根系扫描仪和WinRHIZO根系分析软件对根系的长度、表面积和根尖数等相关指标进行分析。用叶绿素仪（SPAD-502）测定每株植株的第4～6片真叶的SPAD值，并且每个叶片取3个点进行测量取平均值以减小误差。分别取烘干后的根和叶用消煮法进行消解，然后用FP640火焰光度计进行Na+、K+含量测定。硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）活性、亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）活性、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）活性、谷氨酸合酶（Glutamate synthase，GOGAT）活性测定均使用索莱宝公司试剂盒，以每小时每克样本中消耗1 μmol NADH的量为一个酶活单位。全氮含量参考GB/T 6432—2018饲料中粗蛋白的测定（凯氏定氮法）；硝态氮含量参考参考NY/T 1116—2014肥料硝态氮、铵态氮、酰胺态氮含量的测定；氨态氮含量参考T/NAIA 001—2020发酵饲料中氨态氮的测定（凯氏定氮法）。

  1.2.3 15N同位素的示踪和氮利用效率的测定

  将同位素处理后的植株用清水—洗涤剂—清水—0.1%盐酸—3次去离子水的流程进行冲洗，分为叶、茎、主干和根4部分，分别剪碎后按1.2.2的步骤烘至恒重，将样品放入粉碎机中研磨，过65目网筛，每个样品称取4 mg（用百万分之一电子天平）用锡囊包裹，在山东农业大学使用稳定同位素质谱仪（英国 IsoPrime Limited）检测15N丰度。15N相关指标的计算：

  R样 = （δ15N /1000 ＋ 1） × R标；

  标记样品15N丰度 = R样 / （R样 ＋ 1）；

  15N原子百分超 = 标记样品15N丰度 － 15N自然丰度；

  Ndff（%） = [（植物样品中15N丰度（%） － 15N自然丰度（%）] / [肥料中15N丰度（%） － 15N自然丰度（%）] × 100 = 各器官从氮肥中吸收的氮量（g） / 总吸收氮量（g） × 100；

  器官全氮量（g） = 器官生物量（g） × 氮含量（%）；

  器官15N吸收量（g） = Ndff × 器官全氮量（g）；

  氮肥利用率 （%） = 器官15N吸收量（g） / 施15N量（g） × 100。

  式中，R标 = 3676.5 × 10-6；15N自然丰度 = 0.365%。

  1.2.4 数据分析

  试验数据用Excel 2019对各指标进行处理，SPSS 26进行单因素处理和差异显著性检验，Origin 64软件绘制图表。

  2 结果与分析

  2.1 盐碱胁迫对葡萄幼苗生长发育的影响

  生物量的变化是植物对盐碱胁迫综合反应的最优指标，盐碱胁迫会降低葡萄幼苗的鲜质量和干质量，盐碱胁迫下葡萄幼苗叶片、茎、主干和根系的鲜质量分别比对照减少44.6%、20.0%、25.9%和44.0%，干质量分别比对照减少45.3%、13.7%、24.7%、10.71%，可以看出盐碱胁迫对葡萄地上部干质量和鲜质量下降幅度相似，对根系干质量和鲜质量的下降幅度差异较大，鲜质量影响较大，干质量影响较小。

 

  2.2 盐碱胁迫对葡萄幼苗根系表型的影响

  根系是植物与外界进行能量和物质交换的场所，是首先感知到胁迫信息的部位。盐碱胁迫抑制了葡萄幼苗根系的发育，根系颜色较对照更深，呈黑色。盐碱胁迫下葡萄幼苗的总根长、表面积、平均直径、总体积、根尖数以及分叉数都显著下降，分别显著下降32.8%、33.3%、7.4%、37.8%、28.4%和33.1%（表2）。证明在高渗透和高pH的土壤环境中不利于葡萄根系的发育。

 

 

  2.3 盐碱胁迫对葡萄幼苗SPAD值的影响

  盐碱胁迫对葡萄幼苗叶绿素相对含量SPAD值的影响如图1所示，SPAD值是衡量植株叶片叶绿素相对含量的参数，可以表示叶绿素的相对含量。与对照比较，盐碱胁迫下葡萄叶片的SPAD值显著降低12.5%，表明盐碱胁迫降低了叶绿素含量，影响葡萄叶片对光的吸收利用。

 

 

  2.4 盐碱胁迫对葡萄幼苗Na+、K+含量的影响

  植物体内离子均衡是其耐盐碱的重要机制之一，正常条件下植物细胞内的离子处于平衡状态。由图2可以看出，盐碱胁迫会显著增加葡萄叶片和根部的Na+含量，分别显著增加61.6%和30%。叶片中的K+含量总体较高，盐碱胁迫后K+含量相比对照下降幅度较小，减少0.9%，根系中盐碱胁迫后的K+含量显著下降，减少27.3%。盐碱胁迫下葡萄幼苗叶片和根部的Na+/K+比值都显著增加，分别显著增加60.1%和49.3%（图2）。

 

  2.5 盐碱胁迫对葡萄幼苗氮素吸收的影响

  在盐碱胁迫条件下，盐碱成为影响植株氮素吸收利用和转化的重要影响因素，图3是盐碱胁迫对葡萄幼苗叶片和根部硝态氮（NO3-）、氨态氮（NH4+）和总氮含量的影响。盐碱胁迫下NO3-、NH4+和总氮含量在葡萄幼苗的不同器官中存在较大差异。盐碱胁迫下，叶片和根系中的NO3-含量均显著下降，分别下降8.5%和14.4%（图3A）。盐碱胁迫下，叶片中NH4+含量显著减少，比对照减少15.8%，而根系NH4+含量显著增加，比对照增加45.9%，并且盐碱胁迫对根系的NH4+含量影响较大，对叶片的影响较小（图3B）。叶片和根系中总氮含量差异较大，在盐碱胁迫处理后叶片和根系中的总氮含量都显著下降，分别减少7.8%和19%（图3C）。

 

 

  2.6 盐碱胁迫对葡萄幼苗氮同化关键酶活性的影响

  由图4可知盐碱胁迫会抑制葡萄幼苗叶片NR、NiR、GOCAT和GS的活性，抑制根系中NR、GOCAT、GS活性，增加根系中NiR活性。盐碱胁迫下叶片和根系中NR活性分别显著下降19.7%和6.2%。盐碱胁迫下叶片和根系中GS活性都显著下降，进一步抑制了NH4+的转化。盐碱胁迫下叶片和根系中的GOCAT活性均下降，分别比对照下降8.2%和11%，根部GOCAT活性下降更显著。

  2.7 盐碱胁迫对葡萄幼苗15N利用率的影响

  同位素15N-KNO3标记表明，盐碱胁迫下葡萄幼苗15N利用率显著降低，和对照相比，降低53%（图5）。

 

  3 讨论与结论

  盐碱胁迫下植物细胞外的离子浓度高使细胞渗透势降低，细胞中的水分减少造成生理干旱，抑制植物的生长。许多研究表明，盐碱胁迫会造成植物体内营养离子的失衡，渗透调节能力减弱，抗氧化系统受到抑制以及植物的生长受到抑制等严重问题。本研究发现盐碱胁迫会降低葡萄幼苗叶片、茎、主干、根系以及整个植株的干鲜质量，且对叶片鲜质量和干质量影响较大，对根系鲜质量和干质量的影响差异较大，证明盐碱胁迫抑制了葡萄叶片水分和干物质的积累，对葡萄根系的鲜物质积累有较大抑制作用，而对葡萄根系干物质积累的影响较小，证明盐碱胁迫强烈抑制了根系水分的吸收，而较少的抑制根系干物质的积累，作为一种保护手段，减少盐碱胁迫条件下对葡萄幼苗根系功能的影响，维持植物正常的生长发育，从一定程度上延缓盐碱胁迫带来的伤害。

  根系是植物在盐碱胁迫下最先感知到胁迫信息的部位，并且将胁迫信息向地上传递。盐碱胁迫会抑制根系的生长，随盐碱胁迫的增加，土壤中的PH也不断升高，会破坏植物根系组织和减少根表面积等其他根系形态指标，最终导致根系功能失常，营养物质的吸收能力下降。根表面积、根尖数、光合速率等指标是对盐碱胁迫下影响植物幼苗生物量最主要的因素。本研究中盐碱胁迫后葡萄幼苗根系总根长、表面积、平均直径、总体积、根尖数和分叉数都显著降低，杨德翠等对葡萄幼苗的研究表明，盐碱胁迫会降低葡萄的鲜质量并且损伤根系，与本试验结果一致。

  光合作用是绿色植物生长发育必须的也是非常重要的生理代谢过程，光合作用的强弱会影响作物的生长、产量及抗逆性的强弱。叶绿素为吸收和传递光能的光合色素，盐碱胁迫会影响葡萄叶片光合色素的合成。有研究发现，随着盐碱胁迫的时间延长，‘红地球’，‘贝达’葡萄叶片的叶绿素含量逐渐下降。本试验与以上结果相似，盐碱胁迫降低了葡萄叶片的SPAD值，即降低了叶绿素含量，植物中叶绿素含量与光合特征等参数呈正相关，证明盐碱胁迫会抑制葡萄的光合作用。

  盐碱胁迫下植物会大量吸收土壤中的高浓度Na+，破坏细胞中的离子平衡，从而出现破坏细胞膜结构、使细胞代谢紊乱等影响植物正常生长的现象。K+的浓度对植物膜电位、酶活、气孔开闭以及渗透调节能力等生理过程有重要作用。本研究中盐碱胁迫导致葡萄叶片和根系中Na+含量显著增加，对叶片中K+含量影响不大，但显著降低根系中的K+含量。Na+对于大多数植物是有害的，Na+含量的增加会阻碍K+的吸收和运输，导致体内Na+、K+严重失衡，K+的亏缺会阻碍葡萄的正常生长发育，甚至导致死亡，并且叶片中Na+含量增加也是叶绿素含量降低的一个重要原因（图1）。细胞质中高的K+/Na+比值是保证植物细胞最佳代谢功能所必需的。盐碱胁迫下植物吸收的Na+被吸收进入细胞质中，使细胞质中的Na+膜电位下降至静定电位以下，激活膜上的K+通道（如NSCC、GORK和SKOR），使大量K+流出细胞，K+/Na+比值降低，稳态平衡被破坏。Na+/K+比值能反应盐碱胁迫对植物离子含量稳态的影响，比值越高则说明胁迫对K+的抑制作用越强，植物受到的盐碱胁迫越严重。本试验中在盐碱胁迫后显著增加了葡萄叶片和根系中Na+/K+比值，对越橘、苜蓿和大麦的研究中也有相同的结果，即盐碱胁迫使叶片和根系中Na+大量积累，而降低了细胞中K+含量，Na+/K+比值升高。

  氮代谢是植物体重要的生理过程和基础代谢过程，盐碱胁迫下植物往往通过影响不同形态氮含量和氮同化关键酶活性的变化来反应氮代谢水平。植物氮素吸收的能力常受到土壤PH、盐分、土壤微生物等因素影响。土壤盐碱化会增加土壤pH和根系渗透胁迫、毒害土壤微生物，抑制植物对氮素的吸收利用。氮素可分为有机氮和无机氮，而有机氮需要转化为无机氮才能被植物体所吸收，NH4+和NO3-是可以被植物直接吸收利用的无机氮。本研究中发现，盐碱胁迫会降低葡萄叶片和根系中NO3-含量，此研究结果表明盐碱胁迫抑制了根系对NO3-的吸收和向地上部的转运，这与张毅等在番茄中的研究结果一致。本试验进一步的研究结果表明，盐碱胁迫降低了叶片中NH4+含量，但是增加根系中NH4+含量，这可能是由于盐碱胁迫下葡萄根系中NiR活性升高（图4B），使NO2-还原得到的NH4+含量增加，并且从土壤中吸收的NH4+和由NO3-还原转化的NH4+不能及时被代谢，导致根系中NH4+含量增加，而NH4+的积累可能会导致植物氨中毒。

  氮的正常代谢是植物正常生长和发育的基础过程，其中NR、NiR、GS和GOCAT是氮代谢过程中的关键酶，对氮的代谢转化至关重要[33]。植物体吸收的NO3-首先通过NR和NiR被还原为NH4+，NH4+又通过GS和GOCAT以循环的形式协同进行氨的同化。NR是氮同化过程中的第一个关键酶，也是限速酶。本研究中盐碱胁迫也显著降低了葡萄叶片和根系中NR活性，说明盐碱胁迫影响葡萄根部对NO3-的吸收并进一步影响对叶片NO3-的利用。NiR是在细胞质中将NO2-还原为亚硝酸盐NH4+，本研究中盐碱胁迫降低了叶片中NiR的活性，但是增加了根系中NiR的活性，这可能是对葡萄氮素吸收量减少的调节响应，以减轻盐碱胁迫带来的伤害，也可能是根系中NH4+含量增加的一个重要原因。植物体内的NH4+需要立即同化为有机氮才能消除NH4+对细胞的毒性，此过程需要GS-GOGAT循环来实现，GS和GOGAT是该循环过程的关键酶。GS将NH4+和谷氨酸催化合成谷氨酰胺，谷氨酰胺又与α-酮戊二酸反应被GOCAT合成谷氨酸。研究认为GOGAT与GS的变化基本一致；盐碱胁迫下植物叶片中GS、GOGAT活性显著降低,植株的生长受到抑制[29,36]。本试验中,盐碱胁迫下叶片和根系中的GS和GOGAT活性均显著降低，抑制了氨的转化作用。总之盐碱胁迫会降低葡萄叶片和根系中NR、GS、GOCAT的活性，降低叶片中NiR的活性，增加根系中NiR的活性，造成氮代谢紊乱。15N利用率表示植物中由肥料中吸收的15N占施入的总15N肥的百分比。通过对15N同位素的标记，本试验表明盐碱胁迫能够降低葡萄对15N的吸收和利用。

  综上所述，盐碱胁迫下葡萄的正常生长发育和氮代谢受到严重影响。盐碱胁迫减少了3309M嫁接的‘阳光玫瑰’葡萄中物质的积累，抑制了根系的发育，Na+/K+比值增加破坏了离子平衡，叶片中NR、GS、GOCAT和根系中NR、GS、GOCAT活性降低，叶片中NO3-、NH4+、总氮的含量和根系中NO3-、总氮的含量降低，根系中NH4+含量增加，造成氨积累，显著降低了15N利用率。