砧木评价与改良岗位

孙艳 韩斌

  葡萄大多数用于酿酒、鲜食和制干生产，并以其独特的香气和风味特征而闻名。然而，葡萄易受多种病菌侵染。世界各地的葡萄产区，特别是在生长季节气候温暖潮湿的地区，都面临着霜霉病(一种破坏性真菌感染)危害。由专性病原体-霜霉菌（Plasmoparaviticola）引起的葡萄霜霉病属于卵菌纲。霜霉菌主要侵染植物的脆弱部位，如叶片、新梢、卷须、幼果和花序。发病严重时可以造成树体死亡，导致产量大幅下降。

  通常使用杀菌剂来控制葡萄霜霉病。然而，频繁使用杀菌剂可能造成霜霉菌的耐药性。过度依赖杀菌剂不仅会使生产成本增加，还会造成环境污染并给人类健康带来风险。然而，通过传统的杂交育种方法培育抗霜霉病的葡萄品种耗时长、成本高，且易受主观判断的影响，从而导致准确性降低。分子辅助育种(MAS)具有高效和精确的优点，为在苗期筛选杂交后代提供了一种更环保、更健康的方法。此外，MAS有助于整合多种抗性种质，以产生具有持久抗性的品系。

  通过葡萄霜霉病抗性数量性状位点(QTLs)定位，开发分子标记，挖掘候选基因，将从本质上提高抗霜霉病葡萄品种选育的准确性和效率。

  1 试验材料和方法

  1.1 试验材料

  本研究以248株葡萄为试验材料，其中包括“摩尔多瓦”和“阳光玫瑰”，以及由它们杂交获得的246个后代。所有葡萄树均种植于河北省农林科学院昌黎果树研究所葡萄园内。

  1.2 DNA提取

  采用CTAB提取法从葡萄幼叶中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA的浓度。

  1.3 GBTS目标位置选择与杂交探针设计

  基于Illumina 20K芯片和之前的GBS测序数据选择目标位点。对于每个目标位点，设计包含特定位置的探针。

  1.4 文库构建、探针杂交和测序

  进行GBTS文库构建和探针杂交。文库的构建包括四个步骤:（1）DNA超声破碎；（2）DNA片段末端修复，添加A尾；（3）将测序适配体与带有A尾的DNA片段相连接；（4）PCR扩增。

  利用Qubit 2.0荧光计(Thermo Fisher Scientific, CA)评估富集文库的质量。通过质控的样品进入流动池，在MGISEQ-2000平台上使用PE150测序模式进行测序。

  为了评价246个子代和亲本对葡萄霜霉病的抗性，从每个单株上选取第4和第5节位上完全展开的叶片，采集16个直径为1 cm的叶盘。然后进行葡萄霜霉菌离体叶片接种。将接种后的叶片在21°C，80%相对湿度条件下培养12小时，对葡萄霜霉病抗性进行评价。分级标准是1~9分，1代表抗性最低，9代表抗性最高。

  1.5 图谱构建与QTL定位

  利用杂合mSNPs构建遗传图谱。使用“Regression mapping”确定标记顺序，并使用Kosambi函数计算标记之间的遗传距离。最后利用MapChart软件对遗传图谱进行可视化处理。

  采用MapQTL 6.0软件进行QTL定位。采用多QTL 作图 (Multiple QTL mapping, MQM)结合辅助因子精确计算IM检测到的位点，作图步长为0.5 cM。通过1000次排列试验确定LOD阈值(α = 0.05)。

  利用GAPIT(版本3)进行GWAS分析。通过分位数-分位数(QQ)图来评估GWAS算法的有效性。

  2 结果

  2.1 表型分析

  采用1(最敏感)至9(抗性最强)的等级分类标准评估个体的霜霉病抗性。在不同表型评价方法中母本“摩尔多瓦”的平均得分为6.34分，表现出对霜霉病的抗性，父本“阳光玫瑰”的平均得分为5.05分，表现出对霜霉病敏感。

  后代的抗性表现出连续变化，符合正态分布的数量性状。利用3种评价方法对6个独立表型进行评估，分数分布在3 - 7之间。利用SPD方法时，大多数表型分布在4 - 6之间。利用OIV法进行的两次评估中，大多数表型分布在5 - 7之间，分数略高于SPD法。利用LDAYS方法时，个体得分更为分散，在两次重复中最高频率出现在4和5之间。

  2.2 遗传图谱构建

  该遗传图谱由826个杂合mSNPs组成，总遗传距离为1515.99 cM，平均标记间距为1.84 cM(表1)。这些标记均匀分布在19个连锁群中，平均每个连锁群有43.47个mSNPs，连锁群上的标记数39(LG17)-51个(LG3)。各连锁群的遗传距离为64.64 cM (LG3) - 99.78 cM (LG18)，连锁群平均长度为79.79 cM/LG。将遗传图谱的遗传距离与参考基因组中标记的物理距离进行比较，发现各连锁群均具有良好的共线性(图7)，从而得到了质量适宜的高密度遗传图谱，可用于后续QTL定位。

  为了优化候选基因座的映射，选择最接近LOD峰的chr18_29062596 (chr18)作为MQM映射的辅助因子。正如预期的那样，LOD得分显著的范围明显缩小了。抗性QTL定位于83.581 - 85.829 cM，根据最近标记在chr18上定位于28.181 - 30.224 Mbp。该QTL被命名为Rpv33。

  2.3 QTL定位与GWAS分析

  利用此前表型鉴定数据与已构建的融合遗传图谱，使用MapQTL 6.0软件进行QTL定位（图3，S-表1）。在6次独立的IM（区间作图）定位结果中，均在18号染色体84。423 cM处定位到同一个QTL，其PVE（表型变异解释率）最高可达到17。3%。为优化候选QTL的映射，选择最接近LOD峰值的chr18_29062596标记作为MQM（复合区间作图）映射的辅助因子，可将候选位点范围显著缩小，将抗性QTL定位于85.581 - 85.829 cM，根据最近的标记，对应的物理区域范围为28.181 - 30.224 Mbp。用GAPIT (Version 3)中的Blink模型进行GWAS分析，并生成曼哈顿图和QQ图(图4)。在Blink中，在6次独立分析中，有5次在chr18上检测到高于阈值的SNP。log10(p)值最高的SNP位点分别位于29.06 Mbp (817SPD)、29.39 Mbp (817LDAYS)和28.34 Mbp (825SPD、OIV和LDAYS)。此外，我们还尝试了MLM、GLM和FarmCPU模型进行分析，结果相似(图8,S-表2)。 log10(p)最高值位于28.34-29.39 Mbp之间。在一些分析中，尽管没有标记高于阈值，但在类似的位置仍有峰值。与每个曼哈顿图相对应的QQ图显示了显著标记的存在，这些标记偏离了随机效应，并与每组的表型密切相关。

  3 讨论

  3.1 多种表型评分方法对抗性评估准确性的影响

  抗病水平的准确评价是抗病QTL定位的前提。葡萄抗霜霉病的评价方法主要有人工叶片接种法和田间自然侵染法。田间自然侵染法也用于一些研究 ，但由于受天气、种植条件和小气候的影响较大，其准确性和可靠性不如离体叶盘接种法。本研究中涉及的三种基于叶盘接种的方法已在以前的研究中得到应用，并检测到可靠的葡萄霜霉病抗性位点。

  在本研究中，虽然三种方法的结果存在一定差异，但得分的分布符合QTL的正态分布。不同方法之间存在差异的原因是多种多样的。在杂交F1后代中，许多表型可以通过姐妹染色单体的交换而分离，如叶脉、叶表面蜡质层和叶片绒毛。叶脉的突起会限制菌丝体萌发面积的扩大，蜡质层和叶片绒毛会直接影响接种时霜霉菌菌液与叶片背面气孔的直接接触。这些表型最终会影响抗性评分，因此有必要考虑多种方法来准确评估抗性。

  虽然采用不同的方法表型的得分也不同，但基于这些得分的QTL定位和GWAS分析结果也显示出显著的重复性，进一步证实了该位点的可靠性。

  3.2 葡萄的抗性机制多样性

  植物基因组中含有的抗性基因(R基因)所编码的蛋白质能够特异性识别病原菌分泌的效应蛋白，进而引发超敏反应(hypersensitive response, HR)导致程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，进而抑制病原菌的生长，这就是“基因针对性概念”。R基因通常被认为包含两个保守的功能域:核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR) 。基于它们的保守结构域，已在葡萄中预测出了386个候选R基因(Goyal等人，2018)，其中一些在抗白粉病、霜霉病和黑腐病中发挥了重要作用。在18号染色体上，已经报道了分别来自于圆叶葡萄、沙地葡萄和山葡萄的 Rpv2、Rpv3和Rpv24。

  由于葡萄对大多数病害高度敏感，育种者常将北美葡萄与葡萄品种杂交获得所需抗性。然而，据报道格鲁吉亚的一些品种对霜霉病具有抗性，并鉴定出3个抗性位点。然而，研究人员没有观察到HR坏死点，因此认为这种防御机制与在北美和亚洲葡萄中观察到的不同。

然而，在本研究中，我们在“摩尔多瓦”定位了Rpv33，发现该位点含有大量NB-ARC超家族基因，这与之前对R基因的认识一致。因此，我们认为在本研究中，“摩尔多瓦”的抗性仍然是由R基因提供的。

  4  结论

  为了识别鲜食葡萄品种“摩尔多瓦”的葡萄霜霉病抗性位点，对“摩尔多瓦”(抗性亲本)和“阳光玫瑰”(易感亲本)杂交F1代群体的抗性水平进行了测定。根据GBTS群体的测序数据，构建了一个包含826个SNP的高密度遗传图谱，全长为1515.99 cM。通过MapQTL和GWAS分析，在chr18上定位到一个位于27.534 - 30.729 Mbp的葡萄霜霉病抗性位点(27.534 - 30.729 Mbp)，共鉴定出21个RGA。