酿酒葡萄栽培岗位

张克坤 张诗浩

  1 目的意义

  单宁是一种存在于葡萄果实和葡萄酒中的重要酚类物质，富含丰富的营养价值，同时还会影响葡萄酒的颜色、风味和口感结构等。茉莉酸（Jasmine acid, JA）及其挥发性甲酯衍生物其广泛存在于植物体内，能够通过各项信号转导途径以调控植物生长发育和应激反应过程，是一种具有全局调控作用的植物生长调节物质。JAs作为一种植物信号不仅能够调控相关防御基因的表达，也作为一种防御信号刺激植物次生代谢产物的积累，如生物碱、黄酮类物质和萜类物质等。目前存在的调控葡萄酒中单宁的方法多聚焦于酿造过程，而通过有效手段直接促进田间葡萄果实中单宁的合成积累的研究目前还较少。本研究通过对五个不同葡萄生长发育时期外源施用茉莉酸甲酯（MEJA），研究外施MEJA对葡萄果实发育与单宁积累的影响，从而确定适宜单宁积累的MEJA施用最佳时期与浓度，最终为优化酿酒葡萄栽培管理策略，提高葡萄品质提供理论依据。

  2 材料与方法

  2.1 材料

    

  ‘赤霞珠’葡萄果实取自张裕瑞那城堡酒庄（Chateau Changyu Rena），地处中国陕西省咸阳市渭城区，海拔介于600-700米之间，暖温带半干旱大陆性季风气候，年平均气温13℃，昼夜温差大，全年降水适中，日照充足，无霜期长，葡萄生长期有效积温保持在较高水平。土壤为粉质砂壤土，土层深厚，耕作层疏松，富含矿质营养元素，利于葡萄生长。采用篱架单干双臂式树形，均采用相同的田间土肥水和病虫害管理。

  2.2 试验方法    

  2.2.1 MEJA处理

  在五个生长时期对葡萄果穗进行MEJA喷施处理，分别为葡萄的盛花期（E L-23）、坐果期（E L-27）、绿果期（E L-31）、转色前期（E L-34）和成熟前期（E L-36）。具体操作为在处理日9：00对葡萄果实进行MEJA的喷施处理，成熟期进行统一采样。将采样后的果实统一拍照，并于-40℃冻存，后续进行相关指标的检测与分析。

  2.2.2 果粒大小与质量

  随机选取100粒葡萄果实，采用数显游标卡尺测定横纵径，采用电子天平称单粒质量，试验重复3次，结果表示为“平均值±标准差”。

  2.2.3 可溶性固形物

  随机选取100粒葡萄果实揉碎过滤取汁，采用数显糖度计测定可溶性固形物含量，试验重复3次，结果表示为“平均值±标准差”。

  2.2.4 果实总单宁的测定

  葡萄果实前期处理参照文献（张琳，2019）的方法进行提取，每组样品分别取-40 ℃冷冻葡萄50粒，于冰上快速剥取葡萄皮，后用液氮冷冻，研磨成粉，在冷冻干燥机中冻干后，存于-80℃中待用。而后取样品制备提取液，称取0.5 g干粉后加入10 mL盐酸甲醇溶液，超声提取30 min，1000rpm离心10min后，收集上清液，重复以上操作提取三次，合并所有上清液并储存于-80 ℃冰箱中，后续进行总单宁的检测。总单宁的检测参照文献（李芳菲，2020）的方法，采用甲基纤维素沉淀法（MCP法）测定，保留三个生物学重复。

  2.2.5 果实单体单宁的测定

  （1）样品准备：

  取葡萄果皮干粉0.03g，置于2ml离心管中，随即加入0.7ml的2:1(V/V)丙酮水溶液，摇床轻微震荡24h。离心，取上清液，放入10 ml离心管，重复提取两次，合并上清液。用旋转蒸发仪在38℃条件下去除粗体液中的丙酮6h，加1ml甲醇定容，作为单宁提取液。

  （2）间苯三酚反应：

  配置反应液pholo-reagent：在50ml容量瓶中进行，首先配置含有0.1 N HCl的甲醇溶液，再加入间苯三酚（50 g/L）和抗坏血酸（10 g/L）。

  反应： 500µL 葡萄提取液+500µL反应液, 50 °C水浴20 min，然后取出反应后的100µL溶液，加入500µL 终止液终止反应（醋酸钠溶液（40 mM））。最后经0.22μm滤头（聚四氟乙烯，polytetrafluoro-ethylene，PTFE）过滤后上液相。

  （3）标准品配置：

  (-)-epicatechin用来定量不同的单宁组分。首先配制1个已知浓度的（5mg/5ml）表儿茶素（EC）溶液，然后稀释为0.5、0.25、0.125mg/ml，直接作为样品上机，获得标准品峰面积。由此可以得到浓度（mg/L），峰面积（mAU）的标准曲线（每个浓度标准品测定时重复3次）。

  （4）流动相配置：

  A相1%乙酸水，B相为1%乙酸乙腈，配好后进行抽滤除杂质，加入液相前进行超声。每个样品所需A相46ml，B相9ml。提前计算并持续上机。

  2.3 数据处理

  试验数据使用Excel 2016软件进行整理；采用SPSS 18.0数据处理软件进行单因素分析（ANOVA）和独立样本T检验（Student’s t test），检验范围*P＜0.05为显著，检验范围**P＜0.01为极显著；使用Origin 2021进行绘图。所有图表中的试验组重复3次，结果均用“平均值±标准差”表示。

  3. 初步结果

  3.1 MEJA处理后葡萄果实表型变化

  如图1所示，观察经过不同时期的MEJA处理后，成熟期采收不同处理组的葡萄果穗形态特征。横向对比，盛花期和坐果期处理的葡萄果实颜色比后三个时期颜色浅，大小和果穗疏密程度无明显差异；而纵向对比，除在E L-34时期MEJA处理组果实颜色明显比对照组深，其余四个时期内处理组和对照组的果实，在采收时的果实颜色和大小、果穗疏密程度差异不大。

  3.2 MEJA处理对葡萄果实发育影响

  由表1至3可知，横向对比不同时期激素处理下的葡萄果实，发现在绿果期（E L-31）对葡萄果实进行MEJA处理，果实的百粒重最大，达到225.43g；而纵向比较，MEJA处理后的葡萄果实百粒重皆显著大于对照组果实。其次，除了成熟前期（E L-36）处理时期的采收果实的可溶性固形物处理组和对照组差异不显著，前四个处理时期的采收果实，可溶性固形物含量MEJA组显著高于CK组，即MEJA处理提高了果实可溶性固形物，最高处理组高达18.80 Brix%（图2）。同时，比较各时期的果实横纵径可知，未完全成熟期（E L-37）各处理组的果实果粒大小组间差异不大。综上可知，葡萄生长期的MEJA处理可有效增加采收时葡萄果实的百粒重及提高其可溶性固形物含量，促进了果实的成熟，而对葡萄果实的颜色、形态和果穗疏密度等影响不大。

  3.3 MEJA处理对葡萄果实总单宁的影响

  如图3所示，不同时期MEJA处理对葡萄果皮中单宁含量的影响不同。成熟期采样时CK组的单宁含量差别不大，而处理组中单宁含量随着MEJA处理时期的变化，呈现先升高后降低再升高的趋势。在五个处理时期中，MEJA处理组的单宁含量都显著高于对照组，即MEJA处理会促进葡萄果皮中单宁的积累，且以第五个处理时期中的单宁含量为最高值，高达130mg/L，和CK组的差别极为显著，相比于CK组含量提高了85%。

  3.4 MEJA处理对葡萄果实单体单宁的影响

  本试验通过间苯三酚反应的方法，测得葡萄中的7种缩合单宁单体亚基，主要包括儿茶素（Catechin，C）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表没食子酸儿茶素（EGC）和表儿茶素没食子酸酯（Epicatechingallate，ECG）四种儿茶素类化合物。其中具体分为，延伸亚基4种（C-ext、EC-ext 、ECG-ext和EGC-ext）和末端亚基3种（C-t、EC-t和ECG-t）。本试验统计结果仅选取影响显著的C和EC单体的总量及聚合度和没食子酰化进行分析。如表4所示，在各个不同处理时期的葡萄中，EC所占摩尔百分比最高，主要范围集中在60%-70%；同时，多数时期果实中的单宁组分的平均聚合度和没食子酰化程度没有出现明显变化，但盛花期（E L-23）和绿果期（E L-31）处理的葡萄中，MEJA处理后会显著提高没食子酰化的程度，使儿茶素和表儿茶素等单体更多地转化为表没食子儿茶素酯等。

  同时可以发现，在各个时期内部CK组和MEJA组对比结果中，表儿茶素在MEJA处理后，与对照组相比显著提高。盛花期、坐果期、绿果期、转色期和成熟前期处理的果实中EC占比分别提高14%、4.5%、4%、10%和5%，由此可推测MEJA处理对葡萄果实内表儿茶素（EC）的合成积累具有促进作用。

 

 

  4 结论

  （1）MeJA处理有效增加采收时葡萄果实的百粒重及提高其可溶性固形物含量，促进了果实的成熟，而对葡萄果实的颜色、形态和果穗疏密度等影响不大。

  （2）MEJA处理提高了葡萄总单宁含量，其中单体单宁组分中表儿茶素的占比高达60-70%，表明MEJA可能通过促进表儿茶素的合成来增加葡萄单宁积累水平。

  5 尚需进行的工作

  尚需要在MeJA施用的关键时期与最佳浓度的确定等方面做出进一步的探索。