酿酒微生物岗位

秦义 陆瑶 史学容 刘延琳

  酸度是葡萄酒骨架和风味的重要支撑。葡萄酒中有机酸主要来自于葡萄果实及发酵过程中有机酸分解与合成(陈学诗. 2015), 来源于葡萄果实的有机酸主要有酒石酸、苹果酸、柠檬酸等(张方艳等. 2014)；来自于发酵过程的有机酸包括乳酸、乙酸和琥珀酸等。有机酸作为葡萄酒中重要的风味物质(问亚琴等. 2009), 对葡萄酒的颜色、口感、稳定性、风味指数、总酚、单宁、陈酿时间等都有直接的影响(宋淑燕. 2009; Vilelaa et al. 2019)。葡萄酒中适当的酸度能带给葡萄酒清爽口感, 与葡萄酒中甜味、苦味形成良好平衡(文连奎等. 2011; 苏洁. 2013)。

  近年来, 随着全球气温变暖国内外许多干热产区采收时葡萄浆果酸度明显不足的现象愈发突出, 葡萄果实酸度下降、含糖量升高、pH的增加, 不仅使葡萄酒口感粗糙、失去平衡, 在酿造过程中还会增加微生物侵染的风险(刘敏等. 2017)。低酸度条件下, 甚至会有不良代谢物的产生, 长期过量摄入可能会触发相关疾病。因此, 对于国内外部分葡萄酒产区而言, 适量增加葡萄汁或葡萄酒的酸度对优化葡萄酒的理化指标、感官品质抑或饮用安全都有积极作用, 同时酸度的增加还可以显著提升葡萄酒的货架期(张如意等. 2015)。

  葡萄酒生产中常用的增酸的方式主要有物理增酸、化学增酸及生物增酸法, 其中物理方法主要通过电透析和离子交换树脂法来降低葡萄酒的pH(张如意等. 2015)；化学方法则是通过添加一些有机酸, 如苹果酸、酒石酸、柠檬酸或乳酸等(李华. 2017)。但由于这两种方法的费用昂贵而且受到国际葡萄与葡萄酒组织(OIV)相关条例的约束, 并未在发酵工业上的得到广泛应用(Surhone et al. 2010)。微生物在葡萄酒酿造过程中扮演者十分重要的角色。相对葡萄酒中其它有机酸, 如苹果酸和酒石酸等而言, 乳酸不仅酸度更加柔和、口感更为圆润, 还不会随着葡萄酒处理而沉淀, 具有良好的化学稳定性。此外, 这种生物增酸不受OIV相关条例的限制, 具有较为理想的应用前景(Comitini et al. 2011)。目前, 研究生物增酸的菌株多集中酒精发酵(Alcoholic Fermentation,  AF)能力较弱非酿酒酵母上, 且在葡萄酒产业尚未匹配成熟的发酵控制工艺。而乳酸菌近年来也被提出能够增加葡萄酒的酸度。

  1 葡萄酒的酸度及增酸乳酸菌

  乳酸菌(LAB)是一类能利用可发酵糖并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌, 在葡萄酒中通常在AF结束后接入, 启动将L-苹果酸脱羧降解为L-乳酸和CO2的MLF(Toit et al. 2011; Lucio et al. 2017)。近年来, 科研工作者发现可利用乳酸菌的己糖代谢实现葡萄酒增酸。根据其对糖代谢途径和产物种类的差异, 可分为同型和异型乳酸发酵细菌。其中, 在葡萄酒领域广泛使用的嗜酸性的酒酒球菌(Oenococcus oeni, O. oeni)属于异型发酵菌株, 对高酒精的耐受能力较弱, 进行乳酸发酵时会伴随乙酸、CO2等副产物的产生, 会对葡萄酒质量产生不良影响。所以增酸乳酸菌逐渐集中于以植物乳杆菌为例的同型发酵菌中。

  2 植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum,  L. Plantarum)

  L. plantarum是乳酸菌的一种, 属于Lactobacillus sp, 最适生长温度为30-37℃, 最适生长pH为6.5左右, 菌体在MRS培养基上呈圆形、中央凸起、光滑、边缘整齐、白色不透明, 是典型的兼性厌氧菌, 属于同型发酵乳酸菌。L. plantarum对葡萄酒环境具有良好的适应性, 具有潜在启动MLF的能力, 其酿造学特性及增酸效果具有显著的菌株特异性(Lucio et al. 2017)。作为同型发酵乳酸菌, L. plantarum在乳酸发酵时不产或者只会产生少量的乙酸, 因此, L. plantarum也是实现生物增酸的理想菌株(Bordeu et al. 2014; Valdés et al. 2015; Lucio et al. 2016)。徐洪涛等 (2008) 在MRS培养基中筛选出一株高产乳酸的L. plantarum, 发酵产率为3.75 g/L·h, 具有重要的应用价值。Lucio et al (2018) 从31株乳杆菌中筛选得两株具有优良特性的L. plantarum, 探究酵母菌株对其增酸效果的影响。结果表明, 纯乳酸菌发酵Airen葡萄汁7 d后约生成12 g/L乳酸, 使葡萄酒pH降低0.73单位, 具有优良的增酸能力。但其只能利用发酵液中的糖产生乳酸, 不能进行AF, 仍需接种S. cerevisiae才能顺利完成发酵。L. plantarum和S. cerevisiae接种顺序显著影响乳酸菌对葡萄酒的酸化程度。如L. plantarum和S. cerevisiae同时接种发酵时, L. plantarum的生长于代谢会受到葡萄酒环境、酵母及其发酵代谢物的多重抑制(Alexandre et al. 2004; Berbega et al. 2016), 增酸能力较L. plantarum纯种发酵会显著减弱(Lucio et al. 2017)；而在AF前或AF前期接种乳酸菌时, 乳酸菌的存活、乳酸产量及苹果酸的降解率相对较高, 且比酵母纯菌发酵的葡萄酒产生的酵母代谢物(乙醇、甘油和柠檬酸等)较少。故在AF前或AF前期接种L. plantarum以确保其增酸效果, 但L. plantarum提前几天接入能达到葡萄酒最佳的增酸效果和优良的感官品质目前尚无定论。

  在葡萄酒中, L. plantarum同时参与多重代谢过程, 如柠檬酸代谢、氨基酸代谢、糖类代谢、醇类代谢、酯类合成和水解、酚酸降解、蛋白分解等. 产生糖苷酶、蛋白酶、酯酶、酚酸脱羧酶、柠檬酸裂解酶、酚酸脱羧酶等多种次级产物对葡萄酒香气和风味构成尤为重要, 从而增加葡萄酒香气复杂性和馥郁度 (Fumi et al. 2010; Mtshali et al. 2010; Lerm et al. 2011; Du Toit et al. 2011; Bartowsky et al. 2005)。与酒酒球菌(Oenococcus oeni, O. oeni)相比较, L. plantarum不仅具有更多MLF相关的酶类, 而且还能够产生多种具有抗菌活性的物质, 如L. plantarum细菌素是L. plantarum代谢过程中由核糖体合成的, 对热稳定, 对蛋白酶敏感, 具有抗菌活性的蛋白质或多肽, 能抑制或杀死某些葡萄酒中的有害乳酸菌, 从而抑制葡萄酒破败, 部分能替代葡萄酒中SO2作用, 降低SO2的使用量(Bravo et al. 2013)。产细菌素能力也是菌株筛选时的重要指标之一(Lerm et al. 2011)。

  3 L. plantarum的增酸机理

  代谢调控往往是复杂和精确的, 同一个物质可能会参与多条代谢途径或者影响不同的代谢, 物质的产生和降解会受细胞整体状态的调控。L. plantarum为同型乳酸发酵, 其代谢产酸途径主要是EMP和丙酮酸代谢(见图2-1), 它们共同作用使L. plantarum在酒环境下顺利生长繁殖并实现生物增酸。大部分的乳酸菌具有较为完整的糖酵解途径, 但由于其属于兼性厌氧菌, 在呼吸链上和三羧酸循环上并不完善, 因此, 乳酸菌发酵能够使细菌在适应环境下生长繁殖。

  EMP途径又称同型发酵途径, 终端产物丙酮酸作为乳酸代谢途径的关键中间物质, 在产物和能量交换过程中也起到非常重要的作用, 也是糖、蛋白质、脂肪等营养物质的代谢枢纽(Fumi et al. 2010; Onetto et al. 2015)。除此之外, LAB还可以代谢苹果酸、柠檬酸及琥珀酸等有机酸产生乳酸(刘芳等. 2004), 而葡萄酒酒样中苹果酸、乳酸含量差异与乳酸菌糖酸代谢能力相关。丙酮酸代谢糖类的最终产物是乳酸, 降低发酵基质的糖浓度和pH的同时能赋予葡萄酒柔和口感(Fumi et al. 2010; Onetto et al. 2015)。丙酮酸的代谢产物同时也产生其他有机酸(如乙酸、甲酸等)、乙酰辅酶A等多种物质。不仅糖酵解途径可以生成丙酮酸, 也有一些多元醇, 如甘露醇等也可以生成丙酮酸(Liu et al. 2003)。由于不同LAB在基因上存在显著差异, 细胞内的酶系也大有不同, 导致部分相关代谢途径不能表达或存在差异。

  目前, 关于植物乳杆菌对葡萄酒酸度的影响的报道相对较少, 且对于乳酸菌在酒精发酵前或酒精发酵前期接入发酵基质中对葡萄酒酸度的影响并没有进行系统研究和对比, 此外, 关于本土乳酸菌的是否同样存在增酸潜力及其增酸机理的研究目前仍处于空白, 还需进一步加强研究。