蓝莓种质资源鉴定与新种质创制岗

  一、目的意义

  在遗传育种研究中，获得继承双亲基因的真杂种后代是进行品种改良、遗传分析及遗传图谱构建等研究的前提和基础，为了使杂交后代如实反映双亲和群体的遗传特征，初期对杂交后代真实性鉴定十分必要，以避免或降低非杂交后代对群体的影响。在育种实践中，出现非杂交后代的可能性有如下几种：1）异花授粉中非选定父本花粉混入，导致此类后代缺少选定父本的遗传信息而混入其他材料的遗传信息；2）母本植株具有一定的自花受精习性，杂交过程中人工去雄不及时、不彻底可能会产生自交后代；3）杂交种子收集及幼苗管理过程中误引入非双亲杂交后代。由上述原因导致的非杂交后代混杂在群体中，在植物形态特征上不易辨别。而基于DNA的变异分析不受外界环境影响，能真实反映分离群体分子水平上的遗传信息，可靠性高。因此，群体在基因组水平上反映的遗传差异可借鉴于非杂交个体鉴别研究中，但筛选鉴别策略至关重要。

  随着生物技术的快速发展，NGS（next generation sequencing）测序成本不断降低，三代测序和Hi-C技术也广泛应用于遗传群体测序，如何从测序产生的SNP大数据中准确鉴别非杂交后代十分重要，相关方法鲜见报道。由于非杂交后代所含遗传信息不源于或部分源于亲本（如自交后代），会呈现出遗传关系较远和等位基因分离异常等现象。因此，本研究以多年生果树越橘（Vaccinium corymbosum）的正、反交F1代群体为研究对象，通过高通量简化测序获取大量样本（亲本和子代）基因组序列和遗传变异信息，基于子代特有稀有等位变异为核心，重点揭示子代与群体间（不以亲本为标准）的遗传关系以鉴定非杂交后代。探索适合于高通量测序数据且能快速、准确鉴别非杂交后代的方法，排除假阳性样本干扰，为遗传图谱构建、性状定位、遗传育种及高通量分子标记开发等相关研究奠定基础。

  二、技术方法

  （1）提取父本、母本和杂交后代的基因组DNA，利用该物种参考基因组进行电子酶切预测实验，确定酶切组合；

  （2）利用酶切组合对父本、母本和杂交后代的基因组DNA的混合液进行酶切，回收和纯化314~444 bp范围内的PCR产物，切胶后将文库混合，加入一条流动槽中，cBot进行cluster生成，对酶切产物进行末端加A，连接标签和测序接头序列后进行PCR扩增，进行Illumina Hiseq 2500高通量测序。

  （3）对测序后样本序列进行过滤，利用NGS QC-toolkit（v2.3.3）软件清除Illumina下机序列中的接头序列信息，并过滤掉（Trimming）低于20 score质量的碱基序列。过滤后的样本序列经BWA-0.7.10 软件比对到所述四倍体参考基因组上，用Picard 1.118软件标记出来比对并标记在该物种参考基因组上，并依据过滤参数对父本、母本和杂交后代进行基因分型，获得SNP基因型数据；

  （4）在所述MAF > 0.05的SNP基因型数据集中，对所述杂交后代的SNP次等位基因进行K-Means聚类分析，绘制坐标图；

  （5）利用GenoDive version 3.03对所述SNP基因型数据中MAF > 0.05的数据集进行处理和分析，再经Filling-in Missing Data功能随机选取已有等位基因进行填充；采用Amova方法对所述杂交后代的SNP次等位基因进行K-Means聚类分析，设置模拟退火算法为50000步，重复20次；主成分分析采用计算协方差方式对供试蓝莓样品进行统计，并整合K-Means聚类结果通过“scatterplot3d”R分析包绘制坐标图。在所述MAF < 0.05的SNP基因型数据集中，统计所述杂交后代的SNP基因型数据中拥有的稀有等位变异总数和个体特有的稀有等位变异数，利用“ggplot2”R分析包的箱图功能进行分析计数和异常个体标注，筛选所述坐标图中的离群个体，得非杂交后代。

  三、小结

  提供了一种基于简化基因组测序的非杂交后代鉴定方法，基于参考基因组，利用SNP次等位基因频率（MAF）数据集，通过高通量简化测序获取大量样本（亲本和子代）基因组序列和遗传变异信息，基于子代特有稀有等位变异为核心，重点揭示子代与群体间（不以亲本为标准）的遗传关系以鉴定非杂交后代，是一种简单、有效鉴定群体非杂交后代的方法，对于植物新品种选育及遗传分析、遗传图谱构建、性状定位和遗传育种等研究具有重要意义。