鲜食葡萄品种改良岗位

 

  1 材料与方法

  1.1 材料

  利用生长于北京温泉苗圃的‘峰后’（Vitis vinifera×Vitis labrusca）葡萄，植株年龄15年，篱架方式栽培，植株生长健壮。

  1.2 试验方法

  1.2.1 激素处理和采样  

  利用赤霉素5ppm（GA3，Sigma-Aldrich，美国）进行处理，该激素浓度是基于先前的研究(Lu et al. 2016)。将GA3溶解在含有5%乙醇和0.1%Tween 80的溶液中。2017-2019年选取10株‘峰后’葡萄，在开花前（DBA）8天前，每一株葡萄选择4个相同节位的花序，共选取20个花序，其中10个花序去雄，利用5ppm的GA3（Sigma-Aldrich，美国）对去雄后的10个花序进行喷洒花序处理，另外10个花序没有去雄，正常授粉受精作为对照。

  开花后2、6、10、14天，收集各处理的花序，样品分为2份，一份用FAA（50%乙醇，5%冰醋酸和5%甲醛）固定，用于制作石蜡切片进行显微观察。还有一份立即在液氮中冷冻，并保存在-80℃条件下，用于基因表达分析。

  1.2.2 组织形态结构观察与统计分析  

  将FAA固定的子房或幼果通过乙醇系列脱水后，包埋于石蜡中，切成8μm的切片，用番红和固绿染色，然后用Olympus CX31显微镜照相。 使用ImageJ软件测量2、6、10、14DAF的子房或幼果中内、中、外果皮的直径、细胞层数、细胞面积。

  1.2.3 RNA提取和实时PCR分析  

  总RNA通过用改良的CTAB方法（Murray and Thompson 1980）从葡萄的子房/果实中进行提取。使用逆转录酶（Promega,USA）和oligo dT引物，合成多达2μg的RNA合成第一条cDNA。 RT的反应条件如下：将样品在70℃下孵育5min，然后在42℃下孵育1h，然后立即置于冰上。这些cDNA用作模板在ABIPRISM 7500上进行的定量实时PCR（qRT-PCR）。所有实验均进行了三个生物学重复和两个技术重复。VvDELLA1，VvDELLA2，VvDELLA3，VvCEB1，VvEXPA8，VvEXPA11用Primer软件5.0（PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA，美国）设计引物。VvUBQ用作管家基因以使基因表达正常化。相对基因表达水平使用2-ΔΔCt方法进行计算 (Livak and Schmittgen 2001)。所有这些引物在补充表S1中列出。

  1.2.4 酵母双杂交试验  

  利用Matchmaker GAL4的双杂交系统3进行酵母双杂交试验(Y2H)。将VvDELLA2、VvCEB1的全长及分段cDNA序列克隆到pGADT7或pGBKT7载体中(见补充表S2)，通过乙酸锂法将猎物和诱饵构建体共转入酵母菌株AH109中。通过在最小的-Leu/-Trp (SD-2)培养基和含有4mg ml-1 X-α-gal的-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD-4)培养基上生长共转染组合，验证了每个共转染组合的相互作用。

  1.2.5 双分子荧光互作法  

  使用pSPYNE和pSPYCE(见补充表S2)创建表达YFPN和YFPC融合体的构建体(见补充表S2)，并如前所述(Schutze et al. 2009)共同转化到烟草叶片中。注射后的烟草叶片在28℃下8小时/16小时，光/暗循环培养72小时，在共聚焦显微镜(Olympus Fluoview FV1000)下进行绿色荧光蛋白(GFP)荧光观察。

  1.2.6 电泳迁移率测定(EMSA)  

  将VvCEB1的CDS区克隆到PET-30a(+)载体中，生成组氨酸（His）融合蛋白（见补充表S2）。将构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，将细胞在16℃下孵育过夜，之后将其超声处理，裂解液通过镍柱(生物技术(上海)有限公司，中国)收集并纯化蛋白质。用500mM咪唑洗涤纯化的VvCEB1蛋白。通过将互补的寡核苷酸在72℃退火30分钟，合成结构基因的寡核苷酸探针，并用5′-生物素（Sangon Biotech）标记（补充表S3）。根据制造商的说明，使用Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit(Beyotime Biotechnology)进行电泳迁移率测定(EMSA)。

  1.2.7 荧光素酶检测

  将VvCEB1和VvDELLA2的cDNA独立插入pCAMBIA 1305.1植物组成型表达载体，产生35S::VvCEB1和35S::VvDELLA2构建体。将VvEXPA8和VvEXPA11的启动子分别地插入pCAMBIA2300植物组成表达载体以产生pVvEXPA8::LUC和pVvEXPA11::LUC。所用引物列于补充表S2中。使用冻融法(Weigel and Glazebrook 2006)将载体独立转化到Agrobacterium EHA105细胞中。将转化的细胞重新悬浮在含有1mM MgCl2、1mM MES-KOH和50μM乙酰丁香酮的pH5.7的浸润缓冲液中，直到OD600浓度达到1.0。使用无针注射器，将以下等量的各种组合菌悬液(pVvEXPA8::LUC+空载体(1:1)和35S::VvCEB1+pVvEXPA8::LUC(1:1)；pVvEXPA11::LUC+空载体(1:1)和35S::VvCEB1+pVvEXPA11::LUC(1:1)；35S::VvCEB1+pVvEXPA8::LUC(1:1)和35S::VvDELLA2+35S::VvCEB1+pVvEXPA8::LUC(1:1:1)；35S::VvCEB1+pVvEXPA11::LUC(1:1)和35S::VvDELLA2+35S::VvCEB1+pVvEXPA11::LUC(1:1:1))注射到5周龄烟草植株的幼叶中，将植株在24℃下培养3天。然后将注射的叶子剪下，用100mM荧光素(Promega)涂抹，并置于黑暗中5分钟。用NightSHADE LB 985体内植物成像系统(Berthold，德国)观察和成像转化的N.benthamiana叶片。每个实验至少进行3个独立的生物学重复。

  2 结果

  2.1 外源赤霉素处理对‘峰后’葡萄果实早期发育的影响

  开花前利用5ppm外源赤霉素对已去雄的‘峰后’葡萄花序进行处理，发现处理后果实迅速膨大，果实纵径明显长于对照（图1a）。对果实生长曲线进行测量，在开花后2-14天，GA3处理的果实纵径和横径均明显大于同时期的对照果实(图1b,c)。开花后22-30天，虽然GA3处理的果实纵径依然大于同时期的对照果实，但与对照之间的差距越来越小（图1b），而果实横径GA3处理明显低于同时期的对照（图1c）。

 

 

  2.2 外源赤霉素对果实解剖结构的影响

  为了确定 GA3 处理对葡萄果实结构和果皮细胞的影响，将 2 至 14 DAF 的 GA3 处理和未处理‘峰后’幼果的石蜡切片用番红和固绿染色，并使用光学显微镜观察。 2 DAF 时，GA3 处理的子房壁及中果皮略大于对照（图 2a、e）。 在6 DAF时，GA3处理的子房的中果皮开始转变为薄壁细胞，并且子房壁明显变厚（图2b，f）。 在 10 和 14 DAF 时，对照果实中的外果皮细胞排列紧密，一些中果皮细胞变成薄壁组织细胞（图 2c，d）。 GA3处理后，所有中果皮细胞都变成薄壁细胞（图2g，h），特别是在14 DAF时，只有靠近表皮的几层外果皮细胞排列紧密，而其余的则发育成大的、不规则的薄壁细胞（图2h）。

 

  对开花后2天至14天幼果的外果皮、中果皮、内果皮的厚度，细胞层数，细胞大小进行了统计分析。GA3处理与对照果实的外果皮和内果皮厚度在不同发育时期差异不大，但中果皮厚度GA3处理的果实明显大于对照（图3-a和补充图S1a,b）。而GA3处理与对照的果实外、中、内果皮细胞层数没有明显差异（补充图S1c-e）。同时外果皮和内果皮的细胞大小也差异不大（补充图S1f-g），但是外源GA3处理的果实中果皮细胞面积从开花后2天明显大于同时期发育的对照果实（图3b）。

 

  2.3 外源GA3对VvEXPAs基因表达水平的影响

  由于外源GA3处理后，中果皮细胞显著增大。对此，我们测定了细胞膨大相关基因VvEXPA8和VvEXPA11(参与细胞壁的扩张)在赤霉素处理后的表达水平，发现VvEXPA8和VvEXPA11在处理后各个时期均显著高于对照（图4a,b）。这说明外源GA3处理可能通过促进细胞壁松弛基因VvEXPA8和VvEXPA11的表达，使果皮细胞的细胞壁松弛，进而使细胞膨大。

 

 

  2.4 外源GA3对VvDELLAs基因表达及其蛋白水平的影响

  由于GA途径中DELLA蛋白是关键节点，我们测定了外源GA3处理后对VvDELLAs基因和蛋白在幼果期的表达水平变化，发现VvDELLA1基因在处理后2天略低于对照，其余处理后6、10、14天的VvDELLA1 基因表达均高于对照(图5-a)。VvDELLA2基因在GA3处理后的2天和14天都低于对照，尤其是处理后6天和10天VvDELLA2基因的表达，无论是处理还是对照都显著降低(图5-b)。VvDELLA3表达在GA3处理后的2天和14天略高于对照，而在GA3处理后的6天和10天则VvDELLA3表达则低于对照（图5-c）。从基因表达可以看出，VvDELLA2可能在果实早期发育中起主要作用，对此，利用葡萄子叶分析VvDELLA2蛋白是否受到外源GA3的影响，结果显示，外源赤霉素处理后VvDELLA2蛋白表达量明显低于对照（图5-d）。

 

  2.5 GA 信号抑制因子 VvDELLA2 与转录因子 VvCEB1 相互作用

  DELLA 蛋白不具有任何已知的 DNA 结合结构域，主要与转录因子相互作用来调节赤霉素介导的植物发育 [27]。 先前的研究表明，葡萄中的转录因子VvCEB1参与果实细胞的扩张[43]。同时，对幼果膨大期VvCEB1基因表达的分析表明，GA3处理导致比对照更高的表达（图6d）。 因此，我们假设VvDELLA2与VvCEB1相互作用共同调节早期葡萄果实膨大。为了测试 VvDELLA2 和 VvCEB1 是否直接相互作用，我们进行了 Y2H 测定。 我们发现在此测定中 VvDELLA2 确实与 VvCEB1 相互作用（图 6b）。 此外，VvCEB1 的 C 端对于这种相互作用是充分且必要的（图6a，b）。 双分子荧光互补 (BiFC) 测定显示 VvDELLA2-YFPC 和 VvCEB1-YFPN 在本氏烟草细胞的细胞核中相互作用（图 6c）。 这些结果支持了赤霉素可能通过 VvDELLA2 和 VvCEB1 的相互作用调节早期葡萄果实膨大的假设。

  2.6 VvCEB1激活VvEXPA8, VvEXPA11基因表达

  上述研究表明，外源GA3处理促进了VvEXPA8和VvEXPA11基因表达（图4），因此我们分析了转录因子VvCEB1与VvEXPA8和VvEXPA11基因之间的关系。 我们对 VvEXPA8 和 VvEXPA11 基因启动子的分析揭示了 VvEXPA8 和 VvEXPA11 启动子中处存在 VvCEB1 结合位点，EMSA 测定结果表明 VvCEB1 蛋白能够与 VvEXPA8 和 VvEXPA11 启动子中G-box 位点的 DNA 探针形成复合物。 当存在非生物素标记的竞争探针时，结合带显着减弱；当探针突变时，结合带完全消失（图7a），表明VvCEB1可以在体外与VvEXPA8和VvEXPA11启动子结合。荧光素酶检测结果显示，VvCEB1可以激活分别与VvEXPA8和VvEXPA11启动子连接的报告基因LUC的表达（图7b，c），表明VvEXPA8和VvEXPA11启动子受到VvCEB1的调控。 结果表明，VvCEB1可以激活VvEXPA8和VvEXPA11基因的表达。

 

  2.7 VvDELLA2抑制VvCEB1对下游靶基因的激活

  由于VvCEB1可以激活VvEXPA8，VvEXPA11基因启动子，而VvDELLA2与VvCEB1全长和C端之间存在互作关系，VvCEB1 及其 C 末端在酵母中显示转录激活活性（图 7d）。 这些结果使我们怀疑VvDELLA2和VvCEB1之间的相互作用影响VvCEB1对VvEXPA8和VvEXPA11基因的调节。我们利用荧光素酶试验结果显示，只有VvCEB1表达时，可以分别激活与VvEXPA8，VvEXPA11启动子相连的报告基因LUC的表达（图8-a,b），而当VvDELLA2与VvCEB1共表达时，则报告基因LUC的表达受到抑制（图8-a,b）, 这说明VvDELLA2与VvCEB1结合时，抑制了VvCEB1的转录激活功能。