种质资源收集与评价岗位
刘婧汇 孙磊 樊秀彩 张颖 姜建福 刘崇怀
葡萄在长期繁殖栽培过程中产生了许多变异资源，极大地丰富了葡萄的遗传多样性。随着葡萄品种的多样化和种植面积的扩大，葡萄品种之间的交流频繁，行业中经常出现葡萄品种名称混淆、分类标准不一致、分类不清等问题。MNP分子鉴定技术具有成本低、准确度高、重现性好等优点，较目前其他鉴定方法更具竞争力并且在资源研究和植物育种方面具有良好的应用前景。本研究基于31个代表性品种的全基因组重测序数据，开发了一套葡萄通用MNP标记，构建了30份代表性葡萄品种的MNP指纹图谱，为葡萄品种鉴定提供技术支持。
1. 材料与方法
材料：试验材料于2022年6月采集于中国农业科学院郑州果树研究所国家果树资源郑州葡萄圃。利用31个具有代表性的葡萄品种进行MNP标记筛选，所利用的材料具有不同种性、倍性和用途。例如，二倍体酿酒品种‘赤霞珠’‘黑比诺’，二倍体鲜食品种‘阳光玫瑰’‘金手指’，三倍体鲜食品种‘夏黑’，四倍体鲜食品种‘巨峰’，二倍体砧木‘5BB’等。
方法：用CTAB法从新鲜葡萄叶片中提取基因组DNA。使用Nanodrop和1.0%琼脂糖凝胶电泳来评估DNA的浓度和完整性。使用NexteraXT试剂(Illumina)制备全基因组测序文库，最后使用来自Novogene的Illumina Novoseq平台对DNA样本进行测序。基于全基因组重测序数据，将获得的数据与参考基因组进行比较。利用RectChr软件将获得的vcf文件与参考基因组进行比较，分析31份代表性材料的遗传差异。合并vcf文件后，使用vcftools-vcf命令对合并后的vcf文件进行过滤，以便后续分析。采用gcta_1.93.2beta软件进行主成分分析，结构分析采用admixture_linux-1.3.0软件，使用FastTree (2.1.11,-gtr)软件对树进行分析。可视化利用R软件(R版本4.1.1)circlize包(circlize版本0.4.15)进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 582个MNP标记的遗传信息
582个MNP位点包含6078 bp突变位点(图1A)。葡萄是一种高度杂合的品种，夏黑及其早熟芽突变品种的遗传背景相似。582个MNP标记覆盖整个基因组，并且标记均匀分布在19条染色体上(图1B)。MNP位点的选择旨在实现每个位点的高变异性，以便从每个MNP中扩增出多个SNP。利用MNP技术对31个葡萄品种进行了基因分型，成功确定了582个MNP标记。每个MNP标记至少包含2个SNP位点，最多包含10个SNP位点。每个MNP标记的等位基因数为1 ~ 20个。其中，582个MNP标记中，有494个标记的区分率超过80%。此外，利用582个MNP标记对同一品种不同树体提取的样品进行重复检测。结果表明582 MNP标记具有较高的重复性和稳定性。
2.2 MNP技术在葡萄品种鉴定中的可行性分析
利用PowerMarker V3.25和Figtree v1.4.4软件，根据重测序数据和样品倍性及种性绘制31份代表性葡萄品种的聚类图(图2A)，31个葡萄品种可分为5个亚群：第1亚群由5个三倍体欧美杂种组成 (图中紫色的分支)。其中，‘春香无核’‘早夏香’‘天工墨玉’‘三本提’是‘夏黑’的早熟芽变品种。第二亚群和第三亚群由二倍体欧亚种组成，其中第二亚群中有7个品种均为酿酒品种。第四个亚群包括刺葡萄、毛葡萄、河沙杂种、冬河杂种。第五个亚群包括四倍体欧美杂种‘巨峰’及其早芽突变品种‘98-2’和美洲种‘康可’。随后，对31个品种的不同倍性进行PCA分析。根据倍性(图2C)，可分为三大类：二倍体、三倍体和四倍体。基于全基因组重测序数据，对测序样本进行K-means聚类(图2D)。结果表明，当K=8时(图2B)，聚类更为详细。‘罗城毛葡萄’和‘紫秋’作为中国野生品种聚为一组，同时‘夏黑’及早熟欧美杂种‘98-2’被聚为一组。
2.3 60个品种的分类与差异比较
首先，对60个品种的不同种性和倍性进行了主成分分析。根据倍性(图5A)，将其分为三大类:二倍体、三倍体和四倍体。根据用途(图5B)，将其分为鲜食、酿酒、制汁和制干四类。对60个葡萄品种两两比较，共1770个组合(图5C)。结果表明，99%以上的组合差异比大于30%，根据任意两个品种间的差异位点数进行定位。结果表明，三倍体、四倍体和二倍体之间存在较大差异，这是由于三倍体和四倍体之间存在大量杂合位点。‘春香无核’‘早夏香’‘天工墨玉’‘三本提’与‘夏黑’的差异不大，这是由于这些品种均为‘夏黑’的早熟突变，遗传背景非常接近。同时发现‘5BB’‘3309C’‘普赖德’‘代克赛’与其他品种存在较大差异，这是由于这些品种的种性与其他品种差异较大。
3. 结论
从31份葡萄基因组重测序数据中筛选出582个葡萄MNP通用标记，构建了60个代表性葡萄品种的MNP指纹图谱。通过对60份葡萄指纹数据的分析，MNP技术能够准确区分二倍体和多倍体，识别率可达99%以上。此外，60份葡萄种质含有不同种性和不同倍性品种，基本满足了中国葡萄品种鉴定的标准样品要求，首次验证了MNP技术在中国葡萄品种鉴定中的可行性。