石家庄综合试验站
摘要：为探究赤霉素对葡萄未成熟合子胚萌发的影响，本文以金星无核为试材，研究了三种培养基和GA3浓度对其未成熟合子胚萌发的影响。不同培养基对金星无核未成熟合子胚的萌发影响不同，未添加任何激素的1/2MS培养基和ER培养基都可以使其萌发，接种6 d后萌芽率均超过85%，但水琼脂培养基上的萌芽率始终为0%。与空白对照相比，添加GA3能够促进金星无核合子胚的萌发，萌发速度快且萌芽率高；在0.2 mg·L﹣1~1.5 mg·L﹣1的添加范围内，随GA3浓度的增加，胚的萌芽率增高，最高达到93%；但各处理间无显著性差异。
关键词：葡萄；GA3；合子胚；萌发
赤霉素（GA3）是葡萄生产中一种常用的植物激素，可拉长果穗，诱导无核，增大果粒等。此外，GA3对种子萌发和种子活力也有重要影响，用外源GA3浸种可以打破葡萄种子休眠，促进种子萌发，使种子萌发一致。但这些研究大都是在葡萄成熟种子上进行的，GA3对未成熟葡萄种子及胚萌发的影响则鲜有报道。
胚挽救技术作为无核葡萄育种的重要技术手段，使无核葡萄×有核葡萄的杂交育种方式成为现实。该技术中，亲本基因型、接种时期、培养基、培养条件等是重要影响因素。其中，亲本基因型、接种时期和培养基的作用尤为重要。本研究在前期确认了金星无核易于进行胚挽救的基础上，利用胚挽救技术，研究GA3浓度和3种培养基对金星无核葡萄未成熟合子胚萌发的影响。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为河北省农林科学院石家庄果树研究所葡萄试验园内6年生金星无核葡萄。
赤霉素（gibberellic acid），BBI，购自省工生物工程（上海）股份有限公司
1.2 金星无核果粒及胚珠发育状态观察
在金星无核始花期，挑选发育状态一致的花序，将已开放的花蕾去掉，套上果袋，3 d后将未开放的花蕾去掉。以套袋第2天作为开花日期，在花后25 d-50 d内，间隔3~5 d进行胚珠的采集。随机挑选果粒大小均匀一致的果粒，测量10粒果的质量、纵横径，并剥取胚珠，称量其质量，折算为百粒胚珠重。
1.3 不同培养基对金星无核合子胚萌发的影响
金星无核胚珠在组培室内离体培养9周后在解剖镜下剥取合子胚，将其接种于不含任何激素的ER、1/2MS、水琼脂培养基。接种后每日观察胚的萌发情况（以胚的颜色、大小、形态发生明显变化为胚萌发的标记），统计胚的萌芽率。萌芽率（%）=合子胚萌发数/总合子胚数×100。
培养环境为温度25±2 ℃，相对湿度45%～60%，光照强度约为2000 Lx，光照时间14 h/d。光质为发光二极管LED灯复合光质（红蓝白=3:1:1）。
1.4 不同浓度赤霉素对金星无核合子胚萌发的影响
将胚接种于添加了不同浓度GA3（CK: 0 mg·L﹣1、T1: 0.2 mg·L﹣1、T2: 0.5 mg·L﹣1、T3: 1.0 mg·L﹣1、T4: 1.5 mg·L﹣1）的1/2MS（无其它激素）培养基上，观察其接种后的萌芽情况，统计萌芽率。每组10个胚珠，重复3次。培养条件同1.3。
2 结果与分析
2.1 金星无核果粒、胚珠发育动态观察及胚挽救适宜采样时期的确定
金星无核在花后25 d至50 d，其果粒纵横径、单粒重、胚珠重，胚珠质量随着发育进程而增大或增加，其中纵径、横径和单粒重在46 DAF（Days after Flower）达到最大值，横径的增幅大于纵径（图1）。百粒胚珠重在在34 DAF~40 DAF增加较快，在43 DAF降低，随后又继续增加。这与前人研究观察到无核葡萄胚珠发育到一定阶段后质量开始下降的现象相同，而此期与胚的急剧败育期恰好相关联，是适宜进行胚挽救的时期。
2.2 不同培养基对金星无核葡萄合子胚萌发的影响
金星无核葡萄合子胚接种在萌发培养基2 d后，合子胚即开始变绿、增大，3 d子叶开张，4 d子叶展开、胚轴伸长，5 d胚根开始伸长（图2）。在不含任何激素的ER和1/2MS培养基上，合子胚均是接种2 d时开始萌动，4 d大部分胚已萌发，至6 d 萌发率达到最高（表1）。而在水琼脂培养基上，接种第9天，合子胚仍不显示萌动（图3），且出现干瘪、褐化的死亡迹象。
比较金星无核合子胚在1/2MS和ER培养基上的萌芽率，二者均在接种6 d后超过85%，且相差只有2%，表明二者对金星无核合子胚萌发的影响差异不大，结合文献及实验室经验，选取1/2MS作为GA3浓度对胚萌发影响的试验用培养基。
2.3 不同浓度赤霉素对金星无核合子胚萌发的影响
金星无核葡萄未成熟合子胚接种在萌发培养基后2 d即开始萌发，在接种后第3 d~5 d是胚萌发旺盛期（图4）。对合子胚的萌发进行统计分析，T2（0.5 mg·L﹣1）、T3（1.0 mg·L﹣1）、T4（1.5 mg·L﹣1）三个处理的合子胚在培养3 d后的萌芽率均高于对照，且最终萌芽率亦高于对照。其中，T4处理的萌芽率最高，比对照高12个百分点。
故金星无核葡萄未成熟合子胚经GA3处理后，萌芽速度增加，萌芽率高于对照，且1.5 mg·L﹣1的GA3浓度处理最好。但差异分析结果显示，各处理间无显著性差异。
3 讨论与结论
金星无核自交花后45 d~50 d，金星无核×希姆劳特在授粉后49 d可获得最佳的胚挽救效果。本实验室曾对金星无核×瑞都红玉，金星无核×阳光玫瑰杂交后代在不同时期进行胚挽救，结果显示授粉后45 d~50 d进行胚挽救能够获得最高的成苗率。另外，刘佳认为金星无核在果粒着色10%左右时接种胚珠发育率最高，这与本试验中观察到金星无核在41 DAF开始有个别果粒着色，在43 DAF~45 DAF时果粒着色约10%的情况也相互印证。因此，推断金星无核花后43 d合子胚开始败育，在45 DAF~50 DAF采样进行胚挽救可得到较好的效果。
金星无核合子胚在不含激素的1/2MS培养基和ER培养基上均能萌发，且接种6 d后萌芽率超过80%，而在水琼脂培养基上不萌发。这可能是因为金星无核未成熟的合子胚在离体培养8~10周后，多数合子胚已发育至鱼雷型胚或子叶型胚，胚的发育程度较高，在提供了激素以外的营养后，胚就可以萌发。而琼脂不能够给胚提供营养，从而导致胚缺乏营养，逐渐死亡。
赤霉素对葡萄成熟种子萌发的促进作用是明确的，用2000 mg·L﹣1~5000 mg·L﹣1 GA3浸种可以促进葡萄种子的萌发，萌芽一致，且萌芽率较高。对于未成熟种胚的萌发，GA3的使用浓度多在0.2 mg·L﹣1~0.5 mg·L﹣1，但这是在与其它激素同时存在的情况下。赵炅在WPM培养基的最佳GA3浓度筛选试验中发现，0.17 mg·L﹣1 GA3的添加量下，萌芽率最高。而本文试验中，在0.2 mg·L-1 ~1.5 mg·L﹣1范围内，萌芽率随浓度增加而提高，浓度在1.5 mg·L﹣1时，萌芽率最高，达到93%。这可能是由于品种及培养基成分差异而导致。
本文试验中金星无核合子胚在接种后第3天，萌芽率明显高于对照，且添加量在1.5 mg·L﹣1时，萌芽率最高，说明GA3对葡萄未成熟合子胚的萌发具有一定的促进作用。