贺兰山东麓综合试验站

沈甜 许泽华 牛锐敏 黄小晶 陈卫平

  摘要：以赤霞珠、霞多丽、威代尔、左优红等为亲本配置的6个杂交组合的187株后代为材料，采用SSR分子标记对杂交后代的真实性进行鉴定。从10对SSR引物中筛选出双亲位点完全互补的引物对F1代进行扩增，其中有171个单株同时具有父本和母本的特异性条带，确定为真实性杂种，比例为91.44%。采用与抗寒基因连锁的RAPD标记对赤霞珠×左优红和赤霞珠×酒神2个杂交组合的43个F1代单株进行了检测，其中具有抗寒标记的单株为23个。该研究为葡萄杂交后代的鉴定提供参考。

  关键词：葡萄；杂交；分子标记；抗寒性

  由于葡萄具有闭花受精的特点，在杂交过程中可能会因为去雄不及时、花药有残留等因素造成自交结实，或受外源花粉污染造成真假杂种苗混杂，因此对杂交后代进行真实性鉴定十分必要。传统的杂种鉴定主要采用形态学方法，但存在鉴定周期长、受环境影响大的问题，且无法对有细微性状差异的个体进行准确鉴别。分子标记技术可从DNA水平上揭示亲代与子代间的遗传差异，具有不受环境、组织类别、发育时期影响、多态性高、准确快速等优点，为从基因水平上进行杂交后代鉴定提供了有利工具。除了对杂交后代进行真伪鉴定，利用与目标性状连锁的分子标记对杂交后代进行早期选择，也是减少非目标群体数量、降低育种成本的有效手段。目前生产上栽培的葡萄品质多为抗寒性较差的欧亚种，在宁夏等西北地区必须采用埋土防寒的方式才能顺利越冬，增加了葡萄生产成本，因此培育抗寒品种是葡萄育种的重要目标之一。本研究以欧亚种为母本，欧亚种、欧美杂种、欧山杂种为父本配置杂交组合，分别采用SSR标记和RAPD标记对F1代杂种进行真实性鉴定和抗寒性早期筛选，为提高葡萄杂交育种效率奠定基础。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  供试材料来源于宁夏银川市西夏区芦花台宁夏农林科学院综合试验基地，包括7份亲本材料及通过常规杂交得到的187个F1代单株（见表1）。选取健康的幼嫩叶片，装入带标记的试管中，放在装有冰块的泡沫箱中带回实验室，用液氮冷冻后置于-80℃冰箱保存备用。  

  1.2 基因组DNA 的提取与检测

  采用改良CTAB法提取葡萄叶片基因组DNA，具体方法参照全式金PlantZol (EE141)试剂盒，并用UV-IV紫外分析仪检测DNA浓度与纯度，将合格DNA样品置于-20℃条件下保存备用。

  1.3 杂交F1代真实性鉴定

  利用10对SSR标记对父母本材料进行多态性差异分析，选择扩增SSR片段峰型清晰、稳定，主峰明显，双亲位点完全互补的标记对杂交F1代进行真伪性鉴定，其中扩增结果中具有稳定双亲特异位点的杂交后代即为真实杂种。

  具体流程如下：葡萄叶片DNA→M13接头引物PCR扩增→M13接头PCR产物毛细管电泳检测→荧光引物PCR扩增→荧光PCR产物毛细管电泳检测。将毛细管电泳上机结果原始文件导入Genemarker 2.2.0软件，按位点导出峰图、EXCEL位点信息表。

  1.4  抗寒标记引物和PCR扩增

  先采用两个与抗寒基因连锁的RAPD标记对亲本进行筛选，根据抗寒标记对亲本的扩增结果，再对扩增出特异条带的亲本的杂交后代进行检测。试验采用的抗寒基因分子标记引物S238-854（5'-TGGTGGCGTT-3'）和S241-717（5'-TGACGTCCGT-3'）参照张剑侠等。

  2 结果与分析

  2. 1 葡萄杂交F1代真实性鉴定

  2.1.1  SSR多态性引物的筛选

  将10对SSR引物在亲本中进行PCR扩增，有8对SSR引物在亲本间检测出多态性，同一引物在双亲中基因型为完全互补型，即分离类型为 aa × bb、aa × bc、ab × cc、ab × cd 中的一种，且扩增片段峰型清晰、稳定，主峰明显，则可用于后代群体的鉴定。以杂交组合‘霞多丽’ב贵人香’为例，从图1可以看出，引物VrZAG62在双亲之间的分离类型为 ab × cb,引物VVMD7在双亲之间分离类型为 ab × cd，本研究选择VVMD7 用于‘霞多丽’ב贵人香’杂交后代的真实性鉴定。

  2.1.2  杂种后代的鉴定结果

  根据引物筛选结果，分别选择引物VVMD7、VVMD5、VVMD32 对 6 个杂交组合的187 株后代进行鉴定。因为SSR标记为共显性标记，对同时扩增出父母本特异性位点的单株，认定为真实性杂种；只具有母本特异性位点，未扩增出父本特异性位点的单株，则认为是母本自交后代；部分单株除了扩增出母本位点外还有一个未知来源的位点，则可能为外源花粉污染所致。以杂交组合‘霞多丽’ב威代尔’为例，引物VVMD5在两个亲本上进行重扩增，母本和父本基因型分别为233/237，225/249，对杂交后代的扩增出现6种分离类型， D01(233/249)、D06(237/249)、D08(225/233)、D24(225/237)这4种类型的单株均为真实性杂种，D02(233/237)、D26(237/237)类型的单株为母本自交(图2)。

  187个F1杂交后代群体中出现包含有父母本特异位点的个体共有171个，仅出现母本特异位点的个体有15个，出现未知来源位点的个体有1个。即检测的187个后代单株中有171个单株为双亲的杂交后代，比例为91.44%。

  2.2 抗寒杂交后代的早期筛选

  2.2.1 抗寒标记对杂交亲本的筛选

  两个抗寒标记对7个杂交亲本进行PCR分析的分子标记检测结果如图3所示。S238-854检测结果显示7个亲本均出现特异性条带，与实际不符，不适用于对本试验杂交后代早期抗寒性状的鉴定；S241-717对7个杂交亲本进行扩增结果显示，左优红和酒神在717bp处扩增出特异条带，其余亲本未扩增出特异条带，因此抗寒标记 S241-717可用于以左优红、酒神为亲本的杂交后代早期抗寒性初步鉴定。

  2.2.2  抗寒标记对杂交后代的检测

  以左优红和酒神为亲本的杂交组合有2个，分别为赤霞珠×左优红和赤霞珠×酒神。抗寒标记 S241-717 对赤霞珠×左优红14个杂交后代的检测中，出现特异性条带的有10个，编号为J1-J5，J8-J9，J11-J13。抗寒标记S241-717对赤霞珠×酒神29个杂交后代的检测中，出现特异性条带的有13个，编号为K2、K3、K5、K6、K10、K11、K19、K23、K26、K27、K33-35。

  3 讨论与结论

  本研究以葡萄基因组10对SSR引物为基础，筛选出在双亲中基因型完全互补的引物对6个杂交群体的真实性进行鉴定，其中3个杂交群体的杂种率为85.29%～88.89%，3个杂交群体的杂种率为93.33%～96.88%。尹宝颖等对苹果F1代进行杂种鉴定，发现筛选的 9 对多态性标记中，5对完全互补型标记鉴定率达95%以上，而4对不完全互补型标记鉴定率在50%左右。这是由于不完全互补型在双亲间存在1个相同等位基因位点，在杂种后代中因无法判断该等位基因来自父本还是母本，需要进一步验证，所以鉴定能力较差；而完全互补型标记在双亲间无相同等位基因位点，理论上只需1对标记即可鉴定出全部的真杂种。所以本试验中每个杂交群体仅用了一对完全互补型标记进行鉴定。

  本研究采用两个抗寒基因RAPD标记S238-854和S241-717对7个杂交亲本进行检测，S241-717在左优红和酒神两个亲本中扩增出抗寒特异条带；S241-717在赤霞珠×左优红的14个杂交后代中，检测出具有特异性条带的单株10个，赤霞珠×酒神29个杂交后代中检测出具有特异性条带的单株13个，这23个单株是今后抗寒性状观察选择的重要种质资源。