质量安全与营养品质评价岗
张玉 王强等
摘要 :葡萄中含有丰富的齐墩果酸，现有齐墩果酸的检测方法需大量的甲醇溶液作为提取剂，而甲醇对人体具有较大的毒性。本方法通过比较多种溶剂对提取效果的影响，最后确定采用二氧六环以料液比1:10，超声20 min进行提取，提取上清液经高效液相色谱分离测定。该方法仅需5mL二氧六环，提取20 min，提取率相比传统甲醇提高19%，方法回收率为95.6%~99.3%。该方法具有绿色环保，提取简单快速等优点，可以用于葡萄中齐墩果酸的测定。
齐墩果酸是一类五环三萜化合物，广泛存在于葡萄、大枣等水果中。据研究报道，OA 具有护肝、解肝毒、降转氨酶、降血糖、降血脂、抗炎抗病毒、抗突变、抗癌等多重药理作用 。葡萄中的葡萄皮和葡萄籽中都含有丰富的齐墩果酸，建立快速有效的测定葡萄中齐墩果酸的方法，可为正确评价葡萄营养及葡萄皮等副产物利用提供一定的技术基础。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
高效液相色谱仪，冷冻干燥机，-80℃超低温冰箱，Millipore纯水仪制备，水浴超声波清洗器，涡旋振荡器，电子分析天平。
1.1.2 试剂
齐墩果酸对照品，十二烷基硫酸钠，吐温80，乙醇，二氧六环，甲醇。
1.2 材料
新鲜葡萄皮，液氮冷冻磨成粉。
1.3 标准溶液配制
精确称取齐墩果酸对照品5mg至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀配制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。
1.4 齐墩果酸提取条件的优化
1.4.1 提取剂的选择
取样品粉末0.5 g置于试管中，分别加入5 mL不同提取液（0.6%十二烷基硫酸钠乙醇溶液，0.6%吐温80乙醇溶液，乙醇，二氧六环，甲醇），均质1 min后，超声30 min，离心，取上清液过滤膜后进行测定。
1.4.2 料液比的确定
取样品粉末0.5 g置于试管中，分别加入2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL二氧六环，均质1 min后，超声30min，离心，取上清液过滤膜后进行测定。
1.4.3 超声时间的确定
取样品粉末0.5 g置于试管中，分别加入5 mL二氧六环，均质1 min后，分别超声10 min、20 min、30 min、40 min，离心，取上清液过滤膜后进行测定。
1.5 仪器分析条件
色谱柱；流动相∶甲醇－水（92∶8）；流速：0.9 mL／min；检测器波长：210 nm；温度为40℃，进样量 10uL。
1.6 方法学精密度与准确度
1.6.1 标准曲线、定量限和检出限
精密吸取标准贮备液，分别稀释成5、10、25、50、100、150 ㎍/mL，进行测定。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以信噪比（S/N）3：1的质量浓度作为检出限。
1.6.2 精密度：每个样品提取测定6次，6次数据进行方差分析。
1.6.3 回收率：分别于样品中添加0.6 5 mg/g，1.3 mg/g，2 mg/g的标准物质后，进行提取测定，计算回收率。
2 结果
2.1 不同提取剂筛选
由图1可知，不同提取剂的提取效率不同，相对于其他提取剂，二氧六环的提取效率最高，因此，选取二氧六环作为提取剂。
2.2 不同料液比的提取选择
在相同的提取条件下，采用不同的料液比进行提取，结果显示（图2），随着溶液的体积增加，提取率增高，料液比在1：10后，差异不显著，因此选择料液比1：10作为最佳提取条件。
2.3 不同超声时间的选择
对样品进行不同时间的超声提取，结果显示（图3），超声20 min的提取率高于10 min，随后略有下降，但差异不显著，因此选择超声20 min作为提取时间。
2.4 线性关系和检出限
不同浓度的齐墩果酸与峰面积的线性范围为5-150 ㎍/mL，相关系数R2为0.9995，说明齐墩果酸的线性关系良好，可以满足检测分析需要；样品检出限为0.01 mg/g。
2.5 方法精密度
称取样品，按所建立的方法分别进行6次重复提取、测定，以考察方法的重复性，由实验结果可知，重复测定结果的相对标准偏差(RSD)为3.52%，表明方法重复性好，能满足样品测定的重复性要求。
2.6 方法准确度
按照低、中、高三个浓度水平进行添加回收实验（表1）。回收率在在95.6%~99.3%，表明方法具有较高的准确度。
3 结论
建立了葡萄中齐墩果酸的最佳提取测定条件，即称取样品0.5 g置于试管中，分别加入5 mL二氧六环，均质1 min后，超声20min，上清液经高效液相色谱分离，210 nm测定。该方法相比传统的甲醇提取，具有绿色环保，提取简单等优点，可以用于葡萄中齐墩果酸的提取测定。