酿酒微生物岗

刘延琳

  葡萄酒酿造是由发酵过程驱动的，它是一个微生物参与不同生物合成途径的过程，其结果是将葡萄汁转化为葡萄酒并最终决定葡萄酒的质量。随着对生物化学、分子生物学和微生物生理学等复杂机制理解的不断深入，微生物群落和某些物种对葡萄酒酿造过程的影响也开始逐渐变得更加清晰。在酿酒过程中，各种各样具有发酵特性的酵母、丝状真菌和细菌在葡萄酒风格的塑造方面起着至关重要的作用。在苹乳发酵阶段，相关的微生物不仅将碳水化合物转化为乙醇，而且还具有脱羧作用产生一些少量的重要代谢物，这些物质有助于提升葡萄酒的感官品质(Romano et al. 2019)。

  1 酿酒酵母与非酿酒酵母（Non-Saccharomyces yeast）

  已有大量的研究表明，存在于葡萄原料上的酵母菌大部分属于非酿酒酵母属的酵母（Non-Saccharomyces yeast），主要包括汉逊酵母、假丝酵母、克鲁维酵母、梅奇酵母、毕赤酵母和红酵母等，而酿酒酵母则相对少见(Querol et al. 2018)。然而，虽然非酿酒酵母属的酵母在最初的几个小时内开始发酵并发展，但随着发酵进程它们的种群数量却迅速下降，而酿酒酵母（S. cerevisiae）则成为优势菌种，直到酒精发酵结束为止。

  1.1 生长互作

  在发酵过程中，酵母菌种群的变化与一些因素的改变而使得培养基更具有选择性有关。

  这些因素主要包括，营养物质耗尽、厌氧条件、酸度增加、SO2的产生以及乙醇含量的增加，这些改变将最终导致酵母菌的多样性下降。但以上这些条件的改变使酿酒酵母得以存活，因为与非酿酒酵母菌群相比，它们具有更好的抗应激能力。此外，酿酒酵母在与非酿酒酵母进行混合发酵时，还会生成毒性代谢物、中长链脂肪酸等代谢产物，抑制非酿酒酵母的生长。例如，有研究发现在混合发酵时，酿酒酵母会产生一些分子量不同的代谢产物（蛋白类物质），这些物质诱导了克鲁维酵母的衰亡(谭凤玲等 2020)。Torulaspora delbruecki在与酿酒酵母接触后也发生衰亡现象，可能与胞间接触和酿酒酵母释放的可溶性致死分子有关(关雅静等 2016)。但是，酿酒酵母的这种主导优势也并非绝对的。研究发现当汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵时，会争夺发酵液中的微量元素，从而导致后者的营养流失。不同酵母菌之间的生长互作除了抑制效应外，还可能存在协同效应。例如，一些非酿酒酵母具有胞外蛋白酶水解活性，可以将培养基中的蛋白质分解为氨基酸，从而为酿酒酵母所利用(Liu et al. 2015)。总而言之，关于酵母菌生长之间的相互作用，很大程度上取决于酵母菌的种类。

  1.2 代谢层面的互作对葡萄酒品质的影响

  随着对混合发酵在葡萄酒酿造领域的不断深入，关于其影响葡萄酒品质的分子机制也逐渐明晰。如果酿酒酵母和非酿酒酵酵母之间的平衡得到良好的管理，那么它们之间的互作和代谢层面的影响可能会对葡萄酒的感官特性产生积极的影响。例如：Benito等人使用筛选的裂殖酵母来降低葡萄酒中的尿素含量，从而提高丙酮酸含量以增加颜色的稳定性(Benito et al. 2014)。在巴贝拉红酒的酿酒过程中，Englezos等人使用10种不同类型的商业酿酒酵母和Starmerella bacillaris进行混合发酵，并研究了它们之间的互作以及对化学和香气成分的影响(Englezos et al. 2019)。结果表明，单菌发酵时酿酒酵母的平均最大菌落总数为1.3×108 CFU/mL；而混合发酵时该值为3.4×107 CFU/mL。这说明混合发酵抑制了酿酒酵母的生长。此外，从发酵开始到中期（前8天），S. bacillaris的菌落总数平均达到3.4×108 CFU/mL，均高于相应时期的酿酒酵母菌落数（在第二天进行接种），但在发酵后期（8-14天），S. bacillaris菌落总数显著下降，但是酿酒酵母的菌落总数没有明显的变化。其原因可能是与其他非酿酒酵母类似，在营养物质消耗的最初阶段，S. bacillaris在接种酿酒酵母前能充分地利用铵盐。此外，与单菌发酵相比，混合发酵显著降低了葡萄酒中的乙醇、乙酸和乙酸乙酯含量，并提高了甘油、高级醇和酯类物质的含量。这可能是因为混合发酵抑制了酿酒酵母的乙酸及下游代谢通路。而在可接受的阈值范围内（1-15 g/L），混合发酵时甘油含量的增加对葡萄酒的质量有积极的影响，尤其是感官特性。单萜类物质香茅醇在所有混合发酵中的含量均上升，这与β糖苷酶活性的改变而影响糖基化前体的水解有关。值得注意的是，一些非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵会产生积极的互作，而另一些则产生负面的互作。例如，梅奇酵母的加入可以增加总芳香族化合物的浓度，且与生物量无关。葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵，促进了萜烯类和酯类物质的形成，其中乙酸苯乙酯的含量提高了14.6倍，增强了葡萄酒的黄油味和花果香(谭凤玲等 2020)。而假丝酵母与酿酒酵母混合发酵则会降低总芳香族化合物的量。其原因在于两种微生物对营养物质和氧气的竞争，然而有关分子方面的机制还有待于进一步确认(Liu et al. 2015)。

  1.3 酶活性的改变对葡萄酒品质的影响

  非酿酒酵母的另一个潜在的应用就是能够产生特异性的酶，而且这些酶与植物源和动物源的相比具有更高的活性和稳定性。据报道，一些非酿酒酵母，如：克鲁维酵母、汉逊酵母和梅奇酵母具有β-葡萄糖苷酶活性，能够催化分解糖苷态结合的香气物质从而加强葡萄酒的感官特性(Wang et al. 2021)。而且，当这些微生物与酿酒酵母进行混合发酵时，特定酶的活性会改变，从而加强它们影响葡萄酒感官品质方面的作用。Maturano等人比较分析了非酿酒酵母Debaryomyces vanrijiae和Candida sake分别与酿酒酵母混合发酵时重要酶活性的变化，以及这些变化与香气形成之间的关联(Maturano et al. 2015)。结果发现，与单菌发酵相比，两种混菌发酵均显著提高了β-糖苷酶的活性，约为1.8-2.2倍，而蛋白酶的活性则显著降低。此外，两种混菌接种使发酵体系具有木聚糖酶和淀粉酶活性，而单菌发酵则没有检测到这两种酶的活性。进一步使用皮尔森相关系数法进行分析，发现在所有混合发酵中，大部分乙酸酯浓度与酶活性呈显著正相关。乙基酯类是酵母产生的第二大类化合物。在该项研究中，除了其中6种乙基酯与酶活的变化成负相关，己酸乙酯和辛酸乙酯在D. vanrijiae混合发酵体系中与木聚糖酶、淀粉酶和果胶酶的活性成正相关，这两种物质可以赋予葡萄酒愉悦的气味。在C. sake混合发酵体系中，3-甲基丁酸苯乙酯和戊酸乙酯均与木聚糖酶、蛋白酶和β-糖苷酶的活性变化成正相关，这些物质也对葡萄酒的风味产生良好的影响。在高级醇方面，大多数C6醇（cis-3-hexen-1-ol, trans-3-hexen-1-ol, 1-hexanol）与酶活性成负相关，而2-苯乙醇作为初始发酵醪中最丰富的挥发性化合物，发酵后在所有条件下其浓度均显著增加，并与所有混合发酵体系中的酶活性呈显著正相关。类似的研究还见于酿酒酵母和毕赤酵母的混合发酵(Li et al. 2020)。与单菌发酵相比，混合发酵使糖苷酶的活性显著增加。并且糖苷酶活性的提高是萜烯类和C13--norisoprenoids化合物含量升高以及C6化合物含量降低的主要原因，这在高拮抗酿酒酵母混合发酵的葡萄酒中产生了更为优质的果香和花香。

  1.4 新代谢物的生成对葡萄酒品质的影响

  酿酒酵母在与非酿酒酵母混合发酵时，除了发生代谢层面的互作，以及重要酶活性的变化外，还会生成单菌发酵时所没有的新代谢物。这些代谢物可能来自酿酒酵母，在与非酿酒酵母的生长互作中发挥重要的作用，也可能来自非酿酒酵母，从而进一步影响葡萄酒的风味形成。最近，Roullier-Gall等人使用超高分辨率质谱分析技术（代谢组学）对单菌发酵和与不同类型的非酿酒酵母混合发酵后葡萄酒样中的非挥发性代谢物图谱进行分析(Roullier-Gall et al. 2020)。与各自单独发酵相比，酿酒酵母和梅奇酵母混合发酵后共生成126种特有代谢物，可能对葡萄酒的品质产生影响。但是，该研究的局限在于在获得了大量的组学数据以后，只是简单的分析了不同发酵产品的代谢物图谱差异，而没有进一步将这些差异与葡萄酒的感官特性进行关联以揭示通过互作影响葡萄酒品质的机理。另外，一些重要的芳香化合物只有在与非酿酒酵母混合发酵时才能被检测到，说明这些物质是混合发酵体系中的特有代谢物。例如，Ethyl 2-hexenoate，柠檬烯和香叶醇分别是麝香、雷司令和霞多丽白葡萄酒在混菌发酵时（酿酒酵母与S. bacillaris）才会产生的芳香化合物(Vasileios et al. 2018)。这些物质可以赋予葡萄酒独特的芳香，如玫瑰、桂花、凤梨和蜂蜜等香味。

  2 酿酒酵母与细菌

  细菌对葡萄酒的质量既有积极的影响也有消极的影响，而且这种影响主要取决于与酿酒酵母之间的互作。在葡萄酒发酵过程中，乳酸菌和醋酸菌是两个极为重要的细菌菌群。有关酿酒酵母和这两个菌群之间的互作研究已有大量的报道，因此在该部分仅对最新的研究进行简单的总结。它们之间的互作主要对葡萄酒的风味形成和颜色具有重要的作用。Devi等人使用酒酒球菌和植物乳杆菌与酿酒酵母进行混合发酵，它们之间的互作引起糖苷类物质和vitisin B含量的升高以及coumaryl和caffeyl anthocyanin含量的降低，并且显著提高葡萄酒中花青素的含量(Devi and Anu-Appaiah 2020)。值得注意的是，使用植物乳杆菌和酿酒酵母共同发酵可导致吡喃花青素含量的升高，因此具有防止在共接种过程中颜色流失的作用。Plessis等人还研究了酿酒酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母和两种乳酸菌之间的互作对葡萄酒品质的影响，结果表明在两种酵母的混合发酵过程中，使用植物乳杆菌进行苹乳发酵的酒体评价得分更高。因为植物乳杆菌可以缩短MLF的持续时间，增强新鲜的植物香气，改善葡萄酒的酒体(Plessis et al. 2019)。

  3 酿酒酵母与其他真菌

  在葡萄的生长、成熟以及葡萄酒发酵过程中，真菌是一个庞大的群体，除了我们熟知的各种非酿酒属的酵母菌之外，还包括大量的丝状真菌，这些真菌分致病性的和内生的。对于不引起葡萄果实或者植株发生病害的内生真菌，他们参与了葡萄从孕育到成酒的整个过程，对葡萄果实的风味以至最终葡萄酒的风格塑造都具有重要的作用，因此是一个不可忽视的菌群。目前，关于酿酒酵母和葡萄内生真菌之间的互作研究尚处在一个相对空白的领域。因为研究者们普遍认为这些内生真菌通常与葡萄园里的葡萄浆果有关，通常不会在酿酒过程中起到作用。因此，这类微生物可能成为提高葡萄酒品质的潜在研究对象。一些研究表明内生真菌广泛存在于酿酒过程，因此必然会影响酿酒酵母的发酵性能以及代谢特性。或者这一类微生物会合成酿酒酵母不具备的特异性次级代谢物，以及一些特异性酶，影响酿酒进程，从而最终影响葡萄酒的感官特性。

  Liu等人研究了黑比诺葡萄酒发酵过程中内生真菌的相对丰度变化，结果表明在发酵初始阶段，丝状真菌约占全部菌群的75%左右（主要包括出芽短梗霉菌、枝细枝孢菌、黑附球菌和甜叶菜链格孢等），而此时的酿酒酵母丰度仅为5.45%。当发酵启动后，酿酒酵母开始繁殖并逐渐占据菌群的主导地位，在发酵中期和后期相对丰度分别达到66.5%和80.9%，而丝状真菌的相对丰度则迅速下降(Liu et al. 2020)。类似的研究也见于威代尔冰酒的自然发酵过程，在其发酵初始阶段（0-5天），构成真菌群的主要种属为枝孢属、链格孢属和短柄霉属等，而这些微生物与醇类、酸类和酯类物质的形成密切相关(Chen et al. 2020)。例如，青霉菌与葡萄酒中15中芳香物质的形成有关，其中与2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乙醇、乙酸异戊酯和异戊醇的生成成正相关。这说明，内生真菌参与了葡萄酒中香气组成，且可能对葡萄酒的品质具有重要的影响。

  在微生物互作中，内生真菌对葡萄酒品质的影响具有双面性，即正面或负面的。在对马瑟兰葡萄酒中的微生物多样性及香气成分进行分析时发现，茎点霉（Phoma）对33种香气成分的形成具有负面的影响（如酯类物质），但是与β-大马酮的生成成正相关(Lu et al. 2019)。此外，由灰霉和曲霉所产生的β-葡聚糖和赭曲霉毒素A可能会延迟发酵过程中产生风味物质的微生物的活性(Wang et al. 2021)。

  内生真菌除了参与香气形成外，还影响葡萄酒的颜色。一些内生真菌能够产白藜芦醇和黄酮类化合物，这些物质通过与色素成分进行反应能够影响葡萄酒的颜色，或者直接产生色素物质或与色素结合的相关物质，从而进一步影响葡萄酒的颜色(Nan et al. 2018)。此外，由内生真菌合成的酚类物质也可以促进或抑制酒酒球菌的生长和代谢，从而影响二次发酵和葡萄酒的品质(南立军等. 2018)。

  总之，在葡萄酒发酵过程中各种微生物（例如酵母，丝状真菌和细菌）发挥着不同的作用，并可能影响发酵和最终的葡萄酒特性。综上所述，识别和理解酵母和其他微生物菌群之间的相互作用，对于开发新技术来调整葡萄酒的感官特性，以满足一个地区内的消费者需求至关重要。随着优质葡萄酒的消费和消费者对独特葡萄酒的兴趣持续增长，有关微生物多样性对葡萄浆果和葡萄酒发酵影响的研究将会是满足消费者追求独特的、高质量的葡萄酒需求的重要前提条件。

  内生真菌作为广泛存在于葡萄果实或植株的微生物群落，不可避免的参与葡萄酒发酵过程。这一类微生物具有酿酒酵母所不具备的多种次级代谢合成途径，能够产生多种有益生物活性物质（如萜类物质、多酚等）或与香气形成相关的物质，从而影响葡萄酒的感官风味。然而，目前关于内生真菌与酿酒酵母之间互作的研究鲜见报道。本实验室在前期研究中获得了一株产多酚（白藜芦醇及多种黄酮化合物）的葡萄内生丝状真菌Alternaria sp. MG1，大量研究发现该菌所在的属为葡萄酒发酵过程中的非酵母类优势真菌。因此，我们基于MG1和酿酒酵母的混合发酵实验考查了两菌之间的生长互作、代谢互作及由此对葡萄酒品质的影响，结果发现MG1促进了酚类物质的合成，显著提高了葡萄酒的抗氧化性，还促进了C6醇、脂肪酸乙酯、乙酸酯、其他酯类以及萜烯类化合物的合成。另外，MG1在正常范围内显著促进了高级醇类化合物的合成，这对葡萄酒香气具有贡献价值。结果为进一步解析两菌之间的互作机制提供理论基础。